Etude de l'établissement de novo de l'organisation cellulaire chez Vibrio cholerae

Study of the de novo cellular organisation of Vibrio cholerae

• Auteur / Autrice : Anthony Goudin
• Direction : François-Xavier Barre, Elisa Galli
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie moléculaire et cellulaire
• Date : Soutenance le 22/02/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de biologie intégrative de la cellule (Gif-Sur-Yvette, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Stéphanie Bury-Moné
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Romain Mercier, Marie-Eve Kennedy-Val, Philippe Bouloc
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Romain Mercier, Marie-Eve Kennedy-Val

Mots clés

Mots clés contrôlés

Sphéroplastes

Microscopie de fluorescence

Information génétique

Paroi bactérienne

Vibrion cholérique

Mots clés libres

Organisation cellulaire

Paroi bactérienne

Sphéroplaste

Cellular organisation

Cell wall

Spheroplast

Résumé

Vibrio cholerae est un bacille à Gram négatif. C'est l'agent pathogène du choléra. Il est responsable de plus de 100 000 morts par an, ce qui a motivé son étude. Les premières observations de V. cholerae ont montré qu'il avait la forme de bâtonnet incurvée avec un flagelle à une extrémité. Il a par la suite montré que le positionnement du flagelle à une seule extrémité était lié à la polarisation de l'organisation cellulaire du vibrion. Les études de facteurs impliqués dans cette polarisation suggèrent que l'organisation cellulaire des bactéries nouvellement formées découle de celle de leur « mère ». L'objectif de ma thèse était de comprendre si et comment l'organisation cellulaire du vibrion peut être est établie de novo chez V. cholerae. Pour cela, il me fallait dans un premier temps trouver des situations dans lesquelles l'organisation cellulaire était perdue. Deux états non prolifératifs réversibles sont décrits chez V. cholerae : le premier est la phase stationnaire dans laquelle la bactérie entre lorsqu'elle manque de nutriments. Le second état non prolifératif intervient lorsque la bactérie est soumise à certains stress comme le traitement aux antibiotiques ou l'exposition à des températures froides. Ce second état est associé à une perte de la forme en bâtonnet et de la paroi cellulaire : les bactéries adoptent une forme sphérique. On parle de sphéroplastes. J'ai établi l'organisation cellulaire de ces deux états via des techniques de séquençage massif et de microscopie à fluorescence et j'ai étudié le profil réplicatif des cellules, la localisation précise de facteurs impliqués dans la polarité, la ségrégation des chromosomes ainsi que la division cellulaire. J'ai observé une modification notable de l'organisation cellulaire des sphéroplastes. Ces cellules présentent un plus grand nombre de copie du génome, un désassemblage de la machinerie de division ainsi qu'une inactivité de certains acteurs de la polarité et de la ségrégation.J'ai profité pour mes études de la découverte que la présence du L-arabinose (L-ara) dans le milieu de culture induit la transformation des cellules de V. cholerae en sphéroplastes. Un avantage de cette méthode est que les cellules repartent facilement en prolifération quand le L-ara est enlevé, ce qui nous a permis d'étudier le rétablissement de novo de l'organisation cellulaire par vidéo microscopie. J'ai observé que ce rétablissement suit invariablement différentes étapes de manière chronologique. Mes observations m'ont permis de décrire la dynamique de facteurs organisationnels aux différentes étapes du processus. Ainsi, j'ai observé que la réplication reprend dès les premières étapes, accompagnée par une forte activité des protéines impliquées dans la synthèse de la paroi bactérienne. Puis la cellule commence une transition morphologique, la sphère s'allonge et forme des branches dans lesquelles les génomes sont présents. On peut noter durant ces étapes l'activité de la protéine de polarité HubP, responsable de la bonne localisation des chromosomes. Enfin ces branches subissent des évènements de division permettant le retour de la forme en bâtonnet initiale de la bactérie. Une fois la chronologie des acteurs établie, une stratégie systématique basée sur la comparaison du contenu d'une banque de mutant avant et après retour n'a pas permis de mettre en évidence des candidats essentiels au retour. Finalement, les candidats essentiels comme la protéine de division FtsZ ou encore des acteurs impliqués dans la synthèse de la paroi (PBPs, MreB) ont pu être testés en utilisant des inhibiteurs spécifiques ou via des allèles thermosensibles. Seule l'altération du bon fonctionnement et positionnement des machineries de synthèse de la paroi est en mesure d'empêcher le retour à une forme proliférative, montrant l'importance capitale de cette structure pour le rétablissement de novo de la forme en bâtonnet et de l'organisation cellulaire de V. cholerae.

Vibrio cholerae is a gram-negative bacillus. It is the pathogenic agent of cholera and responsible for more than 100,000 deaths per year, which motivated its study. The first observations of V. cholerae showed that it had a curved rod shape with a flagellum at one end. It was later showed that the positioning of the flagellum at one end was related to the polarization of the intracellular organisation of the vibrio cell. Studies of factors involved in this polarization suggest that the intracellular organisation of newly formed bacteria is derived from their mother. The objective of my thesis was to understand if and how the intracellular organization of the vibrio cell can be established de novo in V. cholerae. To do this, I first had to find situations in which cellular organisation was lost. Two reversible non-proliferative states are described in V. cholerae: the first is the stationary phase in which the bacterium enters when it lacks nutrients. The second non-proliferative state occurs when the bacterium is subjected to certain stresses such as treatment with antibiotics or exposure to cold temperatures. This second state is associated with a loss of the rod shape and the cell wall: the bacteria adopt a spherical shape. We speak of spheroplasts. I established the cellular organisation of these two states via massive sequencing and fluorescence microscopy techniques, and studied the replicative profile of the cells, the precise localization of factors involved in polarity, chromosome segregation and cell division. The cells in stationary phase were found to retain the organisation of growing cells, despite the absence of division. On the contrary, I observed a notable modification of the cellular organisation of the spheroplasts. These cells show an increased number of genome copies, a disassembly of the division machinery and an inactivity of some polarity and segregation actors. I took advantage of the discovery that the presence of L-arabinose (L-ara) in the culture medium induces the transformation of V. cholerae cells into spheroplasts. An advantage of this method is that cells readily resume proliferation when L-ara is removed, allowing us to study the de novo recovery of cellular organisation by video microscopy. I observed that this recovery invariably follows different steps in a chronological manner. My observations allowed me to describe the dynamics of organisational factors at different stages of the process. Thus, I observed that replication resumes from the first steps, accompanied by a strong activity of proteins involved in the synthesis of the bacterial cell wall. Then the cell begins a morphological transition, the sphere lengthens and forms branches in which the genomes are present. During these stages, the activity of the polarity protein HubP, responsible for the correct localization of the chromosomes, can be noted. Finally, these branches undergo division events allowing the return of the initial rod shape of the bacterium. Once the chronology of the actors was established, we tried to determine if genetic modifications could alter this process. No mutations for various known non-essential candidates involved in maintaining cell organisation, such as the HubP protein, prevented successful recovery. A more systematic strategy based on comparing the contents of a mutant library before and after return also failed to reveal any new candidates. Finally, essential candidates such as the division protein FtsZ or actors involved in wall synthesis (PBPs, MreB) could be tested using specific inhibitors or via heat-sensitive alleles. Only the alteration of the proper functioning and positioning of the wall synthesis machinery is able to prevent the return to a proliferative form, showing the crucial importance of this structure for the de novo re-establishment of the rod shape and the intracellular organization of V. cholerae.