Optimisation de la préparation greffons hématopoïétiques pour la thérapie cellulaire : expertise moléculaire et fonctionnelle des cellules souches.

par Mathilde Huart

Projet de thèse en Biologie Cellulaire et Physiopathologie

Sous la direction de Philippe Brunet de la grange.

Thèses en préparation à Bordeaux , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé , en partenariat avec Taïeb (laboratoire) et de Cellules souches Hématopoïétiques Normales et Leucémiques (equipe de recherche) depuis le 17-07-2019 .


  • Résumé

    L'Hématopoïèse est le processus physiologique permettant de produire l'ensemble des cellules matures et fonctionnelles du sang qui assurent le transport de l'oxygène, les défenses immunitaires, ainsi que l'hémostase. L'Hématopoïèse a pour origine les Cellules Souches Hématopoïétiques (CSH) qui, en fonction des besoins de l'organisme, s'engagent puis se différencient en Progéniteurs Hématopoïétiques (PH), puis en précurseurs et enfin en cellules matures. Les CSH sont localisées dans des zones spécialisées du microenvironnement de la moelle osseuse (appelées niches hématopoïétiques) où elles sont principalement quiescentes, multipotentes, et possèdent notamment la capacité fondamentale de multiplication sans différenciation (auto-renouvellement) assurant ainsi le maintien d'un pool constant de CSH et donc pérennité de l'hématopoïèse. Dans le contexte de traitement de leucémies, de tumeurs solides ou de maladies génétiques, les CSH sont particulièrement importantes car elles se situent à l'intersection entre l'initiation ou la rechute de la maladie mais aussi de son traitement puisque les CSH sont utilisées en thérapie cellulaires et en thérapie génique. Cependant la mise au point et l'amélioration de ces thérapies nécessitent fréquemment des manipulations ex vivo des cellules qui sont dans la plupart des cas très dommageables pour les CSH. Problématique : Dans le cadre du traitement d'une leucémie ou d'une tumeur solide, le recours à la thérapie cellulaire basée sur l'utilisation d'un greffon hématopoïétique est courant. Le greffon est injecté au patient après que celui-ci ait reçu un traitement par chimio- et/ou radiothérapie (conditionnement du patient). Ce conditionnement provoque une cytopénie, c'est-à-dire une diminution importante dans la moelle osseuse de cellules du système immunitaire, plaçant ainsi le patient dans une situation de grande vulnérabilité. Le greffon qui est composé de CSH et de PH doit donc permettre d'atteindre deux objectifs fondamentaux : 1- assurer, à partir des CSH, la reconstitution d'une hématopoïèse normale à long terme chez le receveur, et 2- générer une hématopoïèse transitoire dans un délai aussi bref que possible à partir des PH afin de réduire autant que possible la phase critique de cytopénie. Afin d'atteindre ce second objectif, le greffon doit contenir une quantité très importante de PH ce qui est rendu possible grâce à l'expansion ex vivo du greffon par culture cellulaire avant son injection au patient. Malheureusement, cette manipulation ex vivo des greffons hématopoïétiques provoque la perte des propriétés fonctionnelles des CSH (capacité d'auto-renouvellement et capacité de greffe) car elles se différencient lors de cette phase de culture. Ceci conduit à l'incapacité du greffon à produire une hématopoïèse durable chez le receveur. Le projet proposé ici a pour but de mieux caractériser les mécanismes impliqués dans la physiologie des CSH humaines afin d'optimiser la préparation des greffons hématopoïétiques utilisés dans le cadre du traitement de patients atteint d'hémopathies malignes. Hypothèse : Afin maintenir l'intégrité du pool de CSH au cours des phases d'expansion ex vivo des greffons hématopoïétiques, il est particulièrement important de caractériser les mécanismes moléculaires impliqués dans la survie des CSH et leur maintien à l'état « souche ». Nous formulons l'hypothèse que l'étude des CSH réalisée dans des conditions de concentrations physiologiques d'oxygène (O2) (proches de celles trouvées dans les niches médullaires, <5% O2) ou en présence d'antioxydants (notre équipe ayant montré l'effet de chacune de ces conditions sur le maintien des CSH en culture ; résumé en [1]), devrait apporter des informations essentielles sur les mécanismes gouvernant ces cellules. De telles informations devraient permettre de développer de nouvelles conditions pour contrôler les CSH pendant la phase d'expansion des greffons avant leur injection aux patients. Objectifs : Sur la base de l'expertise de notre équipe dans le domaine de l'hématopoïèse humaine, des CSH, des modèles de greffes xénogéniques et des cultures à des concentrations physiologiques d'O2, nous proposons d'étudier les propriétés d'auto-renouvellement des CSH in vitro et notamment les mécanismes qui conduisent à la perte de l'auto-renouvellement des CSH, afin d'optimiser leur maintien au cours de la phase d'expansion des greffons, voire de les amplifier. Le projet comporte 4 objectifs principaux : (1) Caractériser de nouveaux antioxydants pour le maintien des capacités d'auto-renouvellement des CSH in vitro (2) Etudier les voies moléculaires gouvernant le maintien et/ou l'auto-renouvellement des CSH en condition de concentrations physiologique d'O2 ou en présence d'antioxydants (3) Evaluer la possibilité d'exploiter et d'optimiser la décroissance spontanée en O2 observée au cours des cultures cellulaires (4) Développer un protocole d'expansion contrôlée des CSH ex vivo Détails du projet et méthodologie : Pour réaliser ce projet nous choisissons comme modèle cellulaire les CSH humaines issues du sang périphérique en homéostasie et celles issues du sang placentaire. Les CSH seront ciblées au sein de la fraction cellulaire immature du sang, fraction CD34+CD38low, grâce à la technique « Side Population (SP) », définissant ainsi la fraction d'intérêt CD34+CD38lowSP. Cette population cellulaire est communément utilisée comme une population très enrichies en CSH dans le domaine de l'hématologie expérimentale. (1) Caractérisation de nouveaux antioxydants pour le maintien des capacités d'auto-renouvellement des CSH in vitro La première partie du projet a pour but d'évaluer les effets des antioxydants sur les propriétés des cellules CD34+CD38lowSP en culture. Tout d'abord, différents antioxydants en cours d'investigation au laboratoire, sont testés pour leurs effets sur la production de ROS (Reactive Oxygen Species) par les cellules, sur le cycle cellulaire et sur l'apoptose. Cette étape permettra de déterminer la meilleure combinaison de molécules et leurs concentrations respectives ayant un effet antioxydant (diminution des ROS) sans toxicité sur les cellules (cycle cellulaire/apoptose). Par la suite, les antioxydants sélectionnés dans l'étape précédente seront testés sur le devenir des CSH et des PH in vitro en utilisant les tests fonctionnels appropriés : test CFC (Colony Forming Cells) pour les PH et test SRC (Scid Repopulating Cells) pour les CSH. (2) Voies moléculaires gouvernant l'auto-renouvellement des CSH en condition de concentrations physiologique d'O2 ou en présence d'antioxydants Puisque les CSH sont spécifiquement mieux préservées in vitro à basses concentrations d'O2 ou en présence d'antioxydants (voir [1]), cela suggère que ces conditions favorisent probablement des programmes génique et métabolique particuliers participant à cette préservation. Au niveau génique : il s'agit de réaliser une analyse du transcriptome sur cellules uniques (« single cell analysis ») en utilisant la technologie CHROMIUM sur des cellules CD34+CD38lowSP fraîchement isolées ou cultivées dans des conditions favorisant le maintien des CSH (basse concentrations d'O2 et en milieu enrichi en antioxydants). Cette étape devrait permettre de révéler les gènes préférentiellement exprimés ou réprimés en lien avec le maintien des capacités d'auto-renouvellement des CSH. Les gènes candidats potentiels seront ensuite étudiés/validés par une approche lentivirale permettant leur surexpression ou leu invalidation. Au niveau métabolique : plusieurs arguments existent en faveur d'un métabolisme particulier des CSH vis-à-vis notamment de la consommation de glucose [2-4]. En condition de basses concentrations d'O2, les cellules ne peuvent pas utiliser l'O2 pour produire leur énergie (ATP). La production d'ATP par les mitochondries (oxydations phosphorylantes, OXPHOS) est donc diminuée, voire arrêtée. Dans ces conditions, les cellules utilisent préférentiellement une autre voie métabolique : la Glycolyse anaérobie. En fonction du niveau d'O2 ou de la présence d'antioxydants dans le milieu de culture, nous proposons de déterminer les principales caractéristiques métaboliques des cellules CD34+CD38lowSP : la masse et l'activité mitochondriales ainsi que la consommation de glucose seront évaluées par cytométrie en flux grâce à des sondes fluorescentes ; la voie de production d'ATP (OXPHOS ou Glycolyse anaérobie) préférentiellement utilisée en culture in vitro sera mesurée grâce à la technologie SeaHorse. (3) Impact de la décroissance spontanée en O2 au cours de la culture cellulaire Des expériences préliminaires réalisées au laboratoire ont montré que la culture de cellules hématopoïétiques CD34+ à 21% O2 (correspondant à la concentration atmosphérique classiquement utilisée dans la plupart des systèmes de culture cellulaire) s'accompagne d'une diminution spontanée de la concentration d'O2 en dessous de 10%. Etant donné le rôle connu des basses concentrations d'O2 sur le devenir des cellules in vitro, ces résultats préliminaires soulèvent la question de l'impact de cette décroissance spontanée en O2 sur le devenir des cellules au cours de la culture, et notamment sur les balances prolifération versus quiescence, et auto-renouvellement versus différenciation. Dans ce contexte nous proposons de poursuivre l'étude de la décroissance spontanée en O2 au cours de la culture cellulaire de cellules hématopoïétiques et notamment de CSH, afin d'atteindre la décroissance spontanée maximale et de définir les conditions de cultures (type cellulaires, milieu de culture, cytokines, prolifération/quiescence, co-culture sur stroma, etc…) favorisant cette décroissance maximale. En parallèle, l'impact de la décroissance spontanée en O2 sur les propriétés fonctionnelles des cellules CD34+CD38lowSP devra être étudié en comparaison à des cellules CD34+CD38lowSP cultivées dans des conditions d'O2 stabilisé à 20-21% (concentration atmosphérique). Dans cette situation, l'impact de chacune des 2 conditions (décroissance spontanée en O2 versus concentration d'O2 stabilisée) devra être comparé pour la prolifération cellulaire (analyse du cycle cellulaire par cytométrie en flux), la différenciation cellulaire (acquisition/perte de marqueurs de différenciation, cytologie), le maintien des CSH (évaluation des cellules SP, tests SRC dans un modèle de souris immuno-déficientes), et l'amplification des PH (test CFC). Dans le même temps, les profils d'expression de gènes et de protéines seront comparés (notamment pour HIF-1α et HIF-2α qui sont des facteurs de transcription assurant les effets des basses concentrations d'O2 dans les cellules), et les modifications du métabolisme cellulaire des cellules CD34+CD38lowSP seront suivies au cours de la culture (Glycolyse anaérobie, OXPHOS, cycle des acides gras et de la glutamine). (4) Développement d'un protocole d'expansion ex vivo des CSH La détermination des évènements géniques (gènes surexprimés ou réprimés) et des caractéristiques métaboliques des cellules CD34+CD38lowSP dans les conditions permettant leur maintien/amplification (basses concentrations d'O2, présence d'antioxydants) comparativement aux conditions induisant leur perte par prolifération et différenciation (concentration d'O2 atmosphérique), fournira une cartographie des besoins des CSH permettant d'assurer leur survie et leur maintien ex vivo. La dernière étape du projet sera de développer les nouvelles conditions de culture adaptées à ces besoins afin de contrôler les CSH ex vivo pendant l'expansion des greffons. Ces conditions devront permettre l'activation ou la répression des gènes spécifiques essentiels au maintien des CSH (déterminés lors de l'analyse du transcriptome en cellule unique), mais aussi apporter les éléments adaptés à leur besoin métaboliques (concentration de glucose, métabolites, ions,…). Ces nouvelles conditions devront être testées dans un protocole d'expansion afin d'évaluer et valider leur supériorité aux milieux actuellement utilisés. Cette évaluation sera basée sur l'activité fonctionnelle des cellules après l'expansion ex vivo et notamment par l'évaluation des cellules SP et le maintien de la capacité de greffe (testé par xénotransplantation dans des souris immuno-déficientes). 1. Ivanovic, Z., Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J Cell Physiol, 2009. 219(2): p. 271-5. 2. Arranz, L., A. Urbano-Ispizua, and S. Mendez-Ferrer, Mitochondria underlie different metabolism of hematopoietic stem and progenitor cells. Haematologica, 2013. 98(7): p. 993-5. 3. Suda, T., K. Takubo, and G.L. Semenza, Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell, 2011. 9(4): p. 298-310. 4. Zhang, C.C. and H.A. Sadek, Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxid Redox Signal, 2014. 20(12): p. 1891-901.

  • Titre traduit

    Improvement of hematopoietic stem and progenitor cells preparation for their use in cell therapy: molecular and functional analysis.


  • Résumé

    Hematopoiesis is the physiologic process allowing the production of matures blood cells that ensure oxygen transport, immune defenses and hemostasis. Hematopoiesis originates from Hematopoietic Stem Cells (HSC) which commit and differentiate into Hematopoietic Progenitors (HP), then into precursors cells and finally into matures cells. HSC are located in very specialized areas of bone-marrow (BM) microenvironment (named Hematopoietic niches) where they are mainly quiescent, multipotent, and display the fundamental capacity to proliferate without differentiation (relf-renewal capacity) ensuring the maintenance of a constant pool of HSC and thus the permanence of Hematopoiesis. In the context of leukemia treatment or genetic diseases, HSC are extremely important since there are positioned at the crossroads between the initiation/relapse of the disease and its treatment. Indeed, HSC could be used in cell therapy and in gene therapy, but the set-up or improvement of these therapies frequently require ex vivo manipulation of hematopoietic cells which is, in most cases, highly damageable for HSC. Issue: In the context of treatment of leukemia or solid tumor, the recourse to cell therapy based on the use of hematopoietic graft is a standard practice. The graft is injected to patient after he received a treatment by chemo- and/or radiotherapy (patient conditioning). This conditioning provokes a dramatic decrease of bone marrow cells (cytopenia) leading to the inefficiency of the immune system and thus to the vulnerability of the patient. The graft which is composed of HSC and HP has to play two fundamental roles: (i) ensuring a long-term normal hematopoiesis from HSC and (ii) generating a transient but as rapid as possible hematopoiesis from HP in order to decrease the duration of the critical phase “cytopenia”. In order to reach this second objective, the graft has to contain a huge number of HP that is achieved by ex vivo expansion of graft. Unfortunately, this expansion leads to the loss of HSC (since they differentiate spontaneously in culture), and thus to the loss of long-term engraftment in patient. The project described below aims to better understand the mechanisms involved in the physiology of human HSC in order to optimize at best the preparation (expansion) of hematopoietic grafts used for cell therapy of patients with hematologic malignancies. Hypothesis: In order to maintain the integrity of the HSC pool during ex vivo expansion of hematopoietic grafts, it is very important to characterize the molecular mechanisms involved in HSC survival and their maintenance in a “stemness” state. Here, we postulate that the study of HSC under physiologic O2 concentrations (<5% O2, related to “hematopoietic niches” into bone marrow) or in antioxidants supplemented medium (our team showed that both conditions allow maintaining HSC ex vivo during culture, resumed in [1]), would bring key information on the mechanism governing these cells. Such information would allow developing new conditions to control HSC during expansion before infusion to patients. Objectives: Based on the expertise of our team in the field of human hematopoiesis, HSC, xenograft model, and cultures at physiologic low O2 concentrations, we propose to study self-renewal properties of human HSC in vitro and notably the mechanisms leading to the loss of HSC self-renewal in order to optimize their maintenance, and even to amplify them, during protocols of graft expansion. This project has four main objectives: (1) To characterize new antioxidants for the maintenance of HSC self-renewal capacities in vitro (2) To study the molecular pathways governing the maintenance and/or self-renewal of HSC at physiologic O2 concentrations or in presence of antioxidants (3) To evaluate the possibility to take advantage et to optimize the spontaneous O2 decrease observed during cell cultures (4) To develop a controlled ex vivo expansion protocol for HSC Details of the project and methods: To carry out this project we choose as cell model the HSC from Steady State Peripheral Blood (SSPB) and Cord Blood (CB). These HSC will be targeting according to the phenotype CD34+CD38low and to the functional property named “Side Population (SP)” delineating thus the cell population CD34+CD38lowSP. This cell population is commonly used in the field of human HSC and is supposed to be the most HSC enriched populations in human. (1) Characterization of new antioxidants for the maintenance of the self-renewal capacities of HSC in vitro This first part of the project aims to evaluate the effect of antioxidants on the fundamental properties of CD34+CD38lowSP in expansion protocols. First, different antioxidants that are under investigation in our Lab at the moment are tested for their effects on ROS (Reactive Oxygen Species) production by cells, on cell cycle and apoptosis. This step will allow determining the best combination of molecules and their respective concentrations having an antioxidant effect (decrease of ROS) without toxicity on cells (cell cycle/apoptosis). Then, the antioxidants selected in the previous step will be tested on HSC and HP fate in vitro by classical functional assays (Colony Forming Cells (CFC) assay for HP and Scid Repopulating Cells (SRC) assay for HSC) routinely used in the laboratory. (2) Molecular pathways governing HSC self-renewal properties under hypoxia and antioxidants Since HSC are specifically better maintained in vitro when O2 concentration is low or in presence of antioxidants (see [1]), this suggests that these conditions probably favor some particular gene and metabolic programs leading to this maintenance of HSC. At gene level: We thus propose to conduct transcriptomic analysis at single cell level by using the CHROMIUM technology on freshly isolated CD34+CD38lowSP and after culture in conditions favoring HSC maintenance (low O2 concentrations and antioxidants complemented medium). This step is expected to reveal genes preferentially expressed or repressed in relation to the maintenance of HSC self-renewal capacities. The putative genes will be then studied/validated by the lentiviral vector technology allowing either overexpression or silencing. At metabolic level: Several arguments exist sustaining a particular metabolism of HSC regarding glucose consumption [2-4]. At low O2 concentrations the cells cannot use oxygen for producing their energy. The ATP production by mitochondria (oxidative phosphorylation, OXPHOS) is thus stopped or slowed down. In this context the cells use another pathway named glycolysis. According to O2 concentration or to the presence of antioxidants in the culture medium, we propose to determine the principal metabolic characteristics of CD34+CD38lowSP cells: mitochondrial mass and activity, and glucose consumption will be measured by flow cytometry thanks to fluorescent probes; the ATP production pathway (glycolysis or OXPHOS) preferentially used in in vitro culture will be measured thanks to SeaHorse technology. (3) Impact of the spontaneous O2 decrease during cell culture We performed some preliminary experiments by culturing hematopoietic CD34+ cells at 21% O2 (corresponding to atmospheric O2 concentration usually used in most culture systems) and we showed, thanks to specific tool, that O2 concentration spontaneously decreases below 10% in the course of culture. Because our group and other have shown the importance of O2 concentrations on the in vitro cell fate, notably for the maintenance of HSC, these preliminary results address the issue of the effects of the spontaneous variations of O2 concentration on cell fate and notably on the proliferation versus quiescence balance and self-renewal versus differentiation balance. We thus propose to continue the investigation of spontaneous variations of O2 concentrations during culture of hematopoietic cells and of HSC in particular in order to reach the maximal spontaneous decrease of O2 and define the culture conditions (cell type, medium, cytokines, proliferation/quiescence, co-culture, etc.) enabling this maximal decrease. In parallel, the impact of the spontaneous O2 decrease on functional properties of CD34+CD38lowSP cells will be investigated in comparison to CD34+CD38lowSP cells cultured in stable 20-21% O2 concentration (atmospheric concentration). In this context, the impact of both conditions (spontaneous O2 decrease versus stable O2) will be compared on cell proliferation (cell cycle analysis by flow cytometry), cell differentiation (acquisition/loss of differentiation markers, cytology), HSC maintenance (SP evaluation and Scid Repopulating Cells assay using immune-deficient mouse model) and HP amplification (Colony Forming Cells assay). In the same time the gene and protein expression will be compared (notably HIF-1α and HIF-2 α that are transcription factors ensuring the effect of low O2 concentrations in cell), and finally the modifications of cell metabolism of CD34+CD38lowSP will be tracked in the course of culture (glycolysis, OXPHOS, fatty acid and glutamine cycles). (4) Development of expansion protocols for HSC in vitro Taken together, the determination of the molecular events (genes up- or down-regulated) and the metabolic characteristics of SP cells in the context of their better maintenance (i.e. low O2 concentrations) compared to the context enabling proliferation/differentiation (i.e. 20% O2) will provide cartography of the stem cells needs that ensure their survival and maintenance ex vivo. In a final step, we will try to develop new conditions and culture medium adapted at best to these needs in order to control stem cells ex vivo. This medium will have to include some elements required for activation and/or inhibition of molecular pathways (determined by the previous single cell transcriptome analysis step) specific to HSC maintenance and some elements adapted to their energetic needs (glucose concentration, metabolites, ions…). These new conditions will be tested in expansion protocols in order to evaluate and validate their superiority to medium currently used. This evaluation will be based on functional activity of cells after ex-vivo expansion such as evaluation of SP cells and maintenance of engraftment capacity that will be tested in immuno-deficient mouse model (xenotransplantation in NSG mice). 1. Ivanovic, Z., Hypoxia or in situ normoxia: The stem cell paradigm. J Cell Physiol, 2009. 219(2): p. 271-5. 2. Zhang, C.C. and H.A. Sadek, Hypoxia and metabolic properties of hematopoietic stem cells. Antioxid Redox Signal, 2014. 20(12): p. 1891-901. 3. Arranz, L., A. Urbano-Ispizua, and S. Mendez-Ferrer, Mitochondria underlie different metabolism of hematopoietic stem and progenitor cells. Haematologica, 2013. 98(7): p. 993-5. 4. Suda, T., K. Takubo, and G.L. Semenza, Metabolic regulation of hematopoietic stem cells in the hypoxic niche. Cell Stem Cell, 2011. 9(4): p. 298-310.