The role of interactive states of immune checkpoint regulators in cancer: determined by advanced quantitative imaging.

par James Miles (James)

Thèse de doctorat en Bioimagerie

Sous la direction de Antoine Italiano et de Banafshe Larijani.

Thèses en préparation à Bordeaux en cotutelle avec l'UPV/EHU , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux) , en partenariat avec Soubeyran (laboratoire) .


  • Résumé

    PD-1/PD-L1 et CTLA-4/CD80 sont des points de contrôle conçus pour favoriser l'autotolérance et éviter les maladies auto-immunes. Les cancers modulent ces points de contrôle, en régulant à la hausse leurs ligands apparentés, pour éviter la destruction immunitaire. Les thérapies de blocage des points de contrôle immunitaires ont amélioré le traitement du cancer, mais seul un petit sous-ensemble de patients obtient des effets durables. La plupart des patients sont stratifiés pour les traitements anti-PD-1 ou anti-CTLA-4 en fonction de l'expression du PD-L1. L'expression du ligand est actuellement évaluée par des approches immunohistochimiques, qui sont subjectives, manquent de quantification et d'une gamme dynamique. Nous avons développé une nouvelle plateforme d'imagerie quantitative, étayée par le transfert d'énergie par résonance de Förster (FRET) résolu dans le temps et déterminé par la microscopie d'imagerie par durée de vie de fluorescence (FLIM) dans le domaine des fréquences, afin de quantifier spatialement ces interactions entre points de contrôle à une résolution de <10 nm. Ce test est appelé immune-FRET (iFRET). Nous avons validé la capacité de l'iFRET à mesurer les engagements PD-1/PD-L1 et CTLA-4/CD80 dans un essai de co-culture cellulaire, puis nous avons appliqué l'iFRET pour déterminer les interactions PD-1/PD-L1 dans une étude rétrospective sur le mélanome malin et le carcinome pulmonaire non à petites cellules (NSCLC) malin. Dans le mélanome et le NSCLC, l'augmentation de l'interaction PD-1/PD-L1, déterminée par l'iFRET, était corrélée à une détérioration de la survie. L'expression de PD-L1 n'a pas permis d'établir une corrélation avec le résultat des patients. Nous avons appliqué l'iFRET à PD-1/PD-L1 et CTLA-4/CD80 dans une étude prospective. Un sous-ensemble de patients atteints de cancer colorectal avec des métastases pulmonaires qui ne répondent pas aux traitements classiques voient leurs métastases traitées par ab lation par radiofréquence (RFA). Entre les traitements par RFA, il a été documenté qu'un effet abscopal peut se produire entre le traitement des poumons un et deux. Nous avons appliqué l'iFRET pour évaluer ces interactions dans les métastases pulmonaires traitées avant et après l'ARF. Bien que nous n'ayons pas pu rendre compte directement des mécanismes d'un effet abscopal, nous avons détecté des modèles d'interaction PD-1/PD-L1 et CTLA-4/CD80 différentiels chez les patients, qui peuvent être utilisés pour prédire à quelles thérapies un patient répondra. Nous avons également détecté une corrélation négative entre l'interaction PD-1/PD-L1 et la densité CD3+ intratumorale. L'engagement des points de contrôle n'est pas non plus corrélé à l'expression des ligands. Cela pourrait changer le paradigme de l'immuno-oncologie et la logique de sélection des traitements des patients. Enfin, nous avons cherché à appliquer l'iFRET et CRISPR/Cas12 pour sonder les mécanismes intracellulaires par le squels le ITSM de PD-1 exerce ses effets négatifs. Nous avons généré des mutations Y248A et Y248E dans l'ITSM de PD-1 et prévoyons de vérifier si la SHP-2 seule ou la SHP-1 et la SHP-2 sont responsables de la transduction du signal. Nous prévoyons également d'évaluer si l'état de phosphorylation Y248 constitue un mécanisme de régulation de l'état d'interaction PD-1/PD-L1. Ces résultats indiquent une nouvelle technique permettant d'évaluer l'engagement des points de contrôle immunitaires dans les échantillons de patients. Cette technique peut être appliquée à une série de points de contrôle immunitaires. Cela donne lieu à la notion de surveillance immunitaire quantitative qui peut suivre la protéomique fonctionnelle des patients au fil du temps. En résumé, l'utilisation de l'iFRET pour réaliser une étude immunitaire quantitative pourrait changer la façon dont les patients sont sélectionnés pour les immunothérapies et pourrait fournir un mécanisme permettant de surveiller la réponse a u traitement.

  • Titre traduit

    Le rôle des états interactifs des régulateurs des points de contrôle immunitaires dans le cancer: déterminé par l'imagerie quantitative avancée.


  • Résumé

    PD-1/PD-L1 and CTLA-4/CD80 are checkpoints designed to promote self tolerance and avoid autoimmune diseases. Cancers modulate these checkpoints, by upregulating their cognate ligands, to avoid immune destruction. Immune checkpoint blockade therapies have enhanced cancer treatment, however, only a small subset of patients experience durable effects. Most patients are stratified for anti-PD-1 or anti-CTLA-4 treatments based on PD-L1 expression. Ligand expression is currently assessed by immunohistochemistry approaches, which are subjective, lack quantitation and a dynamic range. We developed a novel quantitative imaging platform, underpinned by time-resolved Förster resonance energy transfer (FRET) determined by frequency domain fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) to spatially quantitate these checkpoint interactions at a <10nm resolution. This assay is termed immune-FRET (iFRET). We validated the ability of iFRET to measure PD-1/PD-L1 and CTLA- 4/CD80 engagements in a cell co-culture assay and then applied iFRET to determine PD-1/PD-L1 interactions in a retrospective study with malignant melanoma and malignant non-small cell lung carcinoma (NSCLC). In both melanoma and NSCLC, increased PD-1/PD-L1 interaction, determined by iFRET, correlated with a worsened survival. PD-L1 expression failed to correlate with patient outcome. We applied iFRET to PD-1/PD-L1 and CTLA-4/CD80 in a prospective study. A subset of colorectal cancer patients with lung metastases who fail to respond to classical treatments have their metastases treated by radiofrequency ablation (RFA). Between RFA treatments, it has been documented, that an abscopal effect may occur between the treatment of lungs one and two. We applied iFRET to assess these interactions in pre- and post-RFA treated lung metastases. Whilst we could not directly report on the mechanisms of an abscopal effect, we detected differential PD-1/PD-L1 and CTLA-4/CD80 interaction patterns with in patients, which may be used to predict which therapies a patient would respond to. We also detected a negative correlation between PD-1/PD-L1 interaction and intratumoral CD3+ density. Neither checkpoint engagement correlated with ligand expression. This could change the paradigm of immune oncology and the rationale behind selecting patient treatments. Lastly, we sought to apply iFRET and CRISPR/Cas12 to probe the intracellular mechanisms by which the ITSM of PD-1 effects its negative effects. We generated Y248A and Y248E mutations in the ITSM of PD-1 and plan to probe if SHP-2 alone or SHP-1 and SHP-2 are responsible for signal transduction. We also plan to assess whether Y248 phosphorylation state poses a regulatory mechanism that regulates PD-1/PD-L1 interaction state. These results indicate a novel technique by which to assess immune checkpoint engagement in patient samples. This may be applied to a range of immune checkpoints. This gives rise to the notion of quantitative im mune surveyance which may monitor the functional proteomics of patients over time. To summarise, utilising iFRET to carry out quantitative immune surveyance may change the way patients are selected for immunotherapies and may provide a mechanism by which to monitor treatment response.