Mécanismes moléculaires des points de contrôle immunitaires et leur corrélation avec les cibles en aval de la voie PI3Kinase, après ablation par radiofréquence : déterminés par FRET amplifié à résolution temporelle.

par James Miles (James)

Projet de thèse en Bioimagerie

Sous la direction de Antoine Italiano.

Thèses en préparation à Bordeaux en cotutelle avec l'Université du Pays basque à Bilbao, Vitoria-Gasteiz et Saint-Sébastien , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé (Bordeaux) , en partenariat avec Soubeyran (laboratoire) depuis le 07-05-2019 .


  • Résumé

    Les carcinomes à clear cell renal cell carcinomas (ccRCC) sont l'une des tumeurs malignes les plus répandues dans le monde occidental et résistent aux thérapies classiques telles que la chimiothérapie et la radiothérapie. Un site commun de métastases pour ce carcinome se trouve dans les poumons (Callea et al., 2015). L'ablation par radiofréquence (RF) est une thérapie personnalisée efficace actuellement utilisée contre les carcinomes du poumon, dans un cadre métastatique. En ce qui concerne l'immuno-oncologie, la RF peut entraîner la mort de cellules tumorales et la libération ultérieure de grandes quantités de débris cellulaires, qui peuvent à leur tour activer une réponse immunitaire (Palussière et al., 2011, Palussière et al., 2017 ). Le RFA est actuellement utilisé pour éviter ou retarder un traitement systémique chez les patients atteints de maladie oligo-métastatique. Le concept d'oligo-métastases concerne les patients atteints d'une à cinq métastases pouvant être guéries par un traitement local. Pour les patients atteints d'une maladie métastatique plus avancée, une RF peut être proposée après un traitement systémique sur une maladie stable. Plutôt que des patients endurant des effets secondaires toxiques sans l'assurance d'un résultat positif , la RF n'est pas associée à des effets secondaires indésirables. Comprendre les mécanismes moléculaires impliqués dans la RFA permettrait son utilisation combinée à la thérapie immunitaire à une phase précoce de l'intervention thérapeutique, en aidant à une meilleure compréhension de l' effet abscal potentiel de la RFA. De plus, l'effet de RFA sur la régulation du point de contrôle immunitaire reste inconnu, d'où la nécessité de déterminer les voies cellulaires impliquées. Pour étudier les mécanismes moléculaires de manière quantitative, nous utiliserons une plate-forme d'imagerie quantitative Förster Resonance Energy Transfer (aFRET), résolue en temps amplifié, qui permettra de déterminer les états d'activation des oncoprotéines (Akt et STAT3 ) ( Veeriah et al., 2 01 4, Miles et al., 2017) . Akt a été identifié comme un biomarqueur prédictif dans le ccRCC et un état d'activation supérieur a a été corrélé à une dégradation de l'issue du patient (Miles et al., 2017). STAT3 est une oncoprotéine connue pour sa dysrégulation dans divers cancers et son état d'activation devrait également être corrélé à une dégradation des résultats pour les patients. De plus, STAT3 activée peut diaphonie avec la PI3K / Akt phosphoinositide-3 et conduire à une modulation de la signalisation Akt (Figure 1). En ce qui concerne la régulation du point de contrôle immunitaire, les oncoprotéines susmentionnées peuvent entraîner une augmentation de l'expression de PD-L1. Une expression accrue dans PD-L1 pourrait augmenter la probabilité que le ligand interagisse avec le récepteur PD-1 d'une cellule présentant l'antigène (APC). PD-1 / PD -interactions L1 On pense que le résultat dans le recrutement de la SH-2 contenant l'inositol 5 'polyphosphatase 1, (SH P-1). Cette phosphatase déphosphoryle les composants des voies de signalisation du récepteur des cellules T (TCR) / CD28, inhibant ainsi l'activation des cellules T. L 'engagement de PD - L1 conduit probablement à des événements de signalisation dans le CPA mais ceux - ci n'ont pas été suffisamment étudiés. Contrairement aux kinases (qui ajoutent des phosphates aux protéines), les phosphatases (qui éliminent les phosphates) ont été largement ignorées / négligées en tant que cibles thérapeutiques / biomarqueurs. Nous serons Utilisez aFRET pour évaluer de manière quantitative l'état d'activation de SHP-1. Ceci sera initialement modélisé dans des lignées cellulaires ccRCC 2D primaires et métastatiques avant d'être modélisé et évalué dans des sphéroïdes cellulaires ccRCC 3D. L'utilisation de A-FRET pourrait permettre la détermination précise des états d'activation de SHP-1, STAT3 et Akt. De plus, nous utiliserons des inhibiteurs de SHP-1 pour voir si son état d'activation est en corrélation avec l'état d'activation d'Akt. Il a été démontré que les protéines tyrosine phosphatases, telles que SHP-1, régulent négativement l'activation de la PI3K, ce qui réduirait la phosphorylation de l'Akt. En outre, nous utiliserons le FRET immuno-amplifié (iFRET) pour évaluer l'interaction PD-1 / PD-L1 dans le modèle cellulaire 3D, mais en cultivant des sphéroïdes ccRCC sur une couche de base de lymphocytes T Jurkat. Nous utiliserons ensuite iFRET pour corréler les états d'activation de Akt, STAT3 et SHP-1 avec l'interaction PD-1 / PD-L1. Après avoir évalué la voie mécanistique qui relie les biomarqueurs ci-dessus et l'état de l'interaction PD-1 / PD-L1, nous utiliserons iFRET pour évaluer l'état de l'interaction PD-1 / PD-L1 en milieu clinique. Comme indiqué ci-dessus, l'utilisation de RFA entraîne une libération importante de débris cellulaires et d'antigènes de la tumeur. Cette libération d'antigène pourrait polariser le système immunitaire pour s'attaquer à d'autres tumeurs présentant les mêmes antigènes. En tant que gamme de tumeurs régulant positivement l'expression de PD-1, PD-1 / PD-L1, une interactionpourrait empêcher le système immunitaire d'attaquer ces tumeurs. U n définitive, iFRET peut être utilisé pour identifier les patients qui bénéficieraient des médicaments bloquant l'interaction PD-1 / PD-L1 dans ce contexte clinique.

  • Titre traduit

    Immune check-point molecular mechanisms and their correlation with downstream targets of the PI3Kinase pathway, post radiofrequency-ablation: determined by amplified time- resolved FRET.


  • Résumé

    Clear cell renal cell carcinomas (ccRCCs) are one of the most common malignancies in the western world and are resistant to classical therapies such as chemo- and radiotherapy. A common site of metastasis for this carcinoma is in the lung (Callea et al., 2015). An effective personalised therapy currently being utilised against lung carcinomas, in a metastatic setting, is radiofrequency ablation (RFA). With regards to immune- oncology, RFA can result in the death of tumour cells and the subsequent release of large amounts of cellular debris, which in turn can activate an immune response (Palussière, et al., 2011, Palussière et al., 2017). RFA is currently used to avoid or to delay a systemic treatment for patients with oligo-metastatic disease. The concept of oligo-metastases is related to patients with one to five metastases that can be cured by local therapy. For patients with more advanced metastatic disease, RFA may be proposed after a systemic treatment on a stable disease. Rather than patients enduring toxic side effects without the assurance of a positive outcome, RFA is not associated with undesirable side effects. Understanding the molecular mechanisms involved in RFA would allow for its combined use with immune therapy at an earlier phase of therapeutic intervention, aiding the better understanding of the potential abscopal effect of RFA. Moreover, the effect RFA has on immune checkpoint regulation remains unknown, leading to the requirement to determine the cellular pathways involved. To investigate the molecular mechanisms in a quantitative manner, we will utilise, amplified-time-resolved Förster Resonance Energy Transfer (aFRET), a quantitative imaging platform, which will enable the determination of the activation states of oncoproteins (Akt and STAT3) (Veeriah et al., 2014, Miles et al., 2017). Akt has been identified as a predictive biomarker in ccRCC and a higher activation state a has been correlated with a worsened patient outcome (Miles et al., 2017). STAT3 is an oncoprotein known to be dysregulated in a range of cancers and its activation state is also predicted to correlate with worsened patient outcomes. Moreover, activated STAT3 can crosstalk with the phosphoinositide-3 PI3K/Akt pathway and lead to modulation in Akt signalling (Figure 1). With regards to immune checkpoint regulation, the aforementioned oncoproteins can lead to increases in the expression of PD-L1. Increased expression in PD-L1 could enhance the probability of the ligand interacting with the PD-1 receptor of an antigen presenting cell (APC). PD-1/PD-L1 interactions are thought to result in the recruitment of the SH-2 containing inositol 5' polyphosphatase 1, (SHP-1). This phosphatase dephosphorylates components of the T-cell receptor (TCR)/CD28 signalling pathways, thereby inhibiting T-cell activation. Engagement of PD-L1 likely leads to signalling events in the APC but these have not been adequately investigated. Unlike kinases (which add phosphates to proteins), phosphatases (which remove phosphates) have been largely ignored/overlooked as therapeutic targets/biomarkers. We will use aFRET to quantatively assess the activation state of SHP-1. This will initially be modelled in primary and metastatic 2D ccRCC cell lines before being modelled and assessed in 3D ccRCC cell spheroids. The use of A-FRET could allow the precise determination of SHP-1, STAT3 and Akt activation states. Moreover, we will use inhibitors of SHP-1 to see if its activation state correlates with Akt activation state. Protein tyrosine phosphatases, such as SHP-1 have been shown to downregulate PI3K activation, which in turn would reduce Akt phosphorylation. In addition, we will use immune-amplified FRET (iFRET) to assess PD-1/PD-L1 interaction in the 3D cell model but culturing ccRCC spheroids onto a base layer of Jurkat T-cells. We will then use iFRET to correlate Akt, STAT3 and SHP-1 activation states to PD-1/PD-L1 interaction. After assessing the mechanistic pathway which links the above biomarkers and PD-1/PD-L1 interaction state, we will utilise iFRET to assess the PD-1/PD-L1 interaction state in a clinical setting. As stated above, the use of RFA leads to a large release of cell debris and antigens from the tumour. This release of antigen could polarise the immune system to attack other tumours displaying the same antigens. As a range of tumours upregulate PD-1 expression, PD-1/PD-L1, interaction could prevent the immune system from mounting an attack on these tumours. Ultimately, iFRET may be used to identify patients who would benefit from PD-1/PD-L1 interaction blocking drugs in this clinical setting.