ADN circulant nucléaire et mitochondrial et étude de l'influence de l'hypoxie sur leur libération

par Amaëlle Otandault aviviani

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Alain Thierry.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....) , en partenariat avec IRCM - Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier (laboratoire) .


  • Résumé

    Plusieurs travaux s'accordent sur le fait que l'analyse de l'ADN circulant (ADNcir) est un outil à fort potentiel diagnostic, pronostic, théranostic et de suivi en oncologie clinique. Cependant, le manque de standardisation des procédures pré-analytiques, des connaissances approfondies des structures des ADNcir ainsi que les facteurs influençant la dynamique de son relargage constituent des obstacles à son transfert en pratique clinique. C'est dans ce contexte que nous avons choisi d'approfondir l'étude des structures des ADNcir d'origines nucléaire et mitochondriale, évaluer leur utilité clinique en oncologie et étudier l'effet de l'hypoxie sur leur libération. A partir d'une technique de qPCR optimisée et validée cliniquement pour l'analyse des ADN circulants, nous avons quantifié les ADN extracellulaires d'origines nucléaire et mitochondriale dans des milieux de culture cellulaire et dans des plasmas humains et murins. Nos données ont révélé l'influence des procédures pré-analytiques sur la quantification de l'ADN circulant en fonction de l'origine. En effet, nous montrons que la préparation du plasma par séparation en ficoll diminue de manière significative la quantification de l'ADNcir d'origine mitochondriale sans influencer la quantification de l'ADNcir d'origine nucléaire, ce qui suggère la présence de structures de densité différente contenant de l'ADN mitochondrial dans le plasma. D'autre part, j'ai contribué à l'évaluation d'un test de dépistage du cancer basé sur l'analyse de l'ADNcir nucléaire et mitochondrial mise au point au laboratoire. Nos résultats préliminaires montrent de façon significative la capacité diagnostic de ce test sur des cohortes de patients atteints de cancers colorectal (n = 127) versus des individus sains (n = 91) (AUC = 0,8657 ; p < 0,0001). Nous montrons in vitro que l'hypoxie module de manière différente le relargage des ADN extracellulaires en fonction de leur origine, et notamment que l'ADN extracellulaire d'origine mitochondriale semble être régulé négativement en condition hypoxique. In vivo, l'hypoxie entraîne une augmentation de la libération de l'ADNcir d'origine nucléaire (p=0,002), mais pas d'origine mitochondriale, dans le plasma de souris greffées avec des cellules tumorales de cancer de poumon. Pour conclure, les travaux réalisés au cours de cette thèse mettent en lumière : (i) l'intérêt de la mise en place de procédures pré-analytiques standardisées pour la compréhension des origines et structures des ADNcir ; (ii) le fort potentiel diagnostic de l'analyse de l'ADNcir en oncologie ; (iii) et l'influence de l'hypoxie sur le relargage de l'ADN circulant.

  • Titre traduit

    Nuclear and Mitochondrial circulating DNA and study of the influence of hypoxia on their release


  • Résumé

    Different studies converge on the diagnostic, theragnostic and prognostic properties of circulating DNA analysis (cirDNA) in clinical oncology. There remain various obstacles, however, to its transfer to clinical practice. These include the lack of standardization of pre-analytical procedures, and limited knowledge of cirDNA structures and of the factors influencing the dynamics of their release. In this context, we studied the structures of cirDNA of nuclear and mitochondrial origins, evaluated their diagnostic potential, and then evaluated the effect of hypoxia on their release. Using an optimized qPCR technique previously validated in clinical studies for the analysis of cirDNA, we quantified extracellular DNA of nuclear and mitochondrial origins in cell culture medium and in human and mouse plasma. Our data also revealed the influence of pre-analytical procedures on the quantification of cirDNA, depending on its origin. Indeed, we showed that plasma preparation with Ficoll separation significantly reduces the quantification of mitochondrial cirDNA without influencing the quantification of nuclear cirDNA. In addition, we evaluated the value of nuclear and mitochondrial cirDNA analysis in a cancer-screening test developed in the laboratory. Our preliminary results demonstrated a significant discrimination between colorectal cancer patients (n=127) and healthy individuals (n=91) (AUC=0.8657; p<0.0001). We demonstrated that in vitro hypoxia modulates the release of extracellular DNA in different ways, depending on its origin, and showed that extracellular DNA of mitochondrial origin is negatively regulated. By contrast, we demonstrated in vivo that hypoxia leads to a greater release of nuclear cirDNA (p=0.002), but not of mitochondrial cirDNA, as compared to normoxia. These experiments were performed using the plasma of mice grafted with lung cancer tumor cells. In conclusion, the work carried out for this thesis highlights: (i) the importance of setting up standardized pre-analytical procedures when investigating the origins and structures of cirDNA; (ii) the strong diagnostic potential of cirDNA analysis in oncology and (iii) the influence of hypoxia on the release of cirDNA.