'SUJET INTERFACE BIOLOGIE SANTE' Nucléation, croissance et déstabilisation de pores dans des membranes de globules rouges sains et infectés par le parasite du paludisme.

par Loïc Dumas

Projet de thèse en Physique

Sous la direction de Manouk Abkarian et de Catherine Braun-Breton.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de École Doctorale Information, Structures, Systèmes (Montpellier ; 2015) , en partenariat avec DIMNP - Dynamique des Interactions Membranaires Normales et Pathologiques (laboratoire) depuis le 31-08-2014 .


  • Résumé

    Le globule rouge (GR) a été étudié par les physiciens comme un modèle relativement simple de cellule biologique. Ses propriétés visco-élastiques reflètent la structure composite de sa membrane qui est formée d'une bicouche fluide de lipides sur laquelle vient s'ancrer un réseau bidimensionnel de filaments de spectrines, connectés à la membrane par des noeuds mobiles de complexes protéiques. La résilience et la stabilité du GR au passage des plus petits capillaires sanguins sur les 120 jours de son existence, proviennent d'une compétition entre l'élasticité de courbure de la bicouche lipidique et la résistance au cisaillement et à la dilatation locale du cytosquelette sous-jacent. Aux très fortes contraintes de cisaillement, la membrane peut se rompre et un pore peut apparaître. Cette perforation du GR que l'on nomme hémolyse peut intervenir aussi bien dans les cas physiologiques à de fortes contraintes mécaniques mais également dans le cas de maladies de la microcirculation pour lesquelles la membrane du GR est modifiée. Nous pouvons citer par exemple la sphérocytose héréditaire, ou l'elliptocytose pour lesquels l'interaction entre le cytosquelette et la bicouche est affaiblie ou bien encore la drépanocytose et le paludisme où les causes de la fragilité membranaire sont encore loin d'être résolues. Cette fragilité et la rupture de la membrane des globules rouges participent aux symptômes cliniques de ces maladies et représentent donc des phénomènes essentiels à comprendre afin d'en diminuer leurs effets ou bien d'en maîtriser leur évolution pour des applications biomédicales faisant intervenir la manipulation, le stockage et la numération du sang. Du point de vue physique, la dynamique d'ouverture d'un pore dans une membrane lipidique simple est un phénomène complexe qui n'a été compris que durant les trois dernières décennies de recherche. L'image qui en ressort est que la nucléation d'un pore et sa dynamique est le résultat de la compétition qui existe entre la tension de ligne qui règne sur les bords du pore et qui tend à le refermer et la tension de surface de la membrane qui s'y oppose [1]. Un des résultats marquant est qu'un pore dans une membrane lipidique peut s'auto-cicatriser par une réduction de la tension de surface lors de l'ouverture du pore, qui permet à la tension de ligne de jouer son rôle cicatrisant. Il n'existe pas encore d'étude expérimentale, ni de modèles conséquents de l'ouverture de pores dans des membranes biologiques. Leur complexité inhérente au soutien de la membrane par un cortex actif d'actine lui même sous tendu par un cytosquelette tri dimensionnel rend la tâche de modélisation et de compréhension physique de la dynamique d'ouverture de pores ardue. Même dans le cas simple d'ouverture de pores dans un globule rouge où la structure de la membrane est plus « simple », il n'y a pas encore d'étude expérimentale de la nucléation et de suivi de la dynamique de poration. D'un point de vue théorique, l'effet de l'interaction entre la bicouche lipidique et le cytosquelette sous jacent sur la dynamique d'ouverture d'un trou et sa stabilité n'est pas encore exploré ce que ce projet de thèse se propose de faire dans le cas de globules rouges sains et dans le cas d'une maladie de la microcirculation sanguine qu'est le paludisme, où la déstabilisation de la membrane du globule rouge par poration est une fonction biologique essentielle pour la survie du parasite. Contexte biologique : la cas du paludisme Le paludisme (ou malaria en anglais) est une maladie dont l'ensemble des symptômes sont dus au développement d'un parasite intracellulaire dans les globules rouges et cause près d'un million de décès par an dans le monde. La forme invasive du parasite que l'on nomme un mérozoïte envahit un globule rouge en s'entourant de sa membrane sans la percer pour former un compartiment spécifique appelé la vacuole parasitophore (VP). Au cours, de son cycle érythrocytaire, et pour les besoins de sa croissance, de sa multiplication et sa sortie, le parasite modifie grandement la membrane de sa cellule hôte et de sa VP. Après 48h de multiplication, les 16 à 32 mérozoïtes nouvellement formés s'échappent du globule rouge grâce à la rupture séquentielle de la VP puis de la membrane du globule rouge et peuvent ainsi infecter d'autres globules rouges de la circulation. Les symptômes cliniques de la maladie résultent de ce cycle d'invasion et d'évasion successives. La compréhension des mécanismes de sortie du parasite est donc de première importance pour le développement de thérapies innovantes. Grâce à une approche interdisciplinaire entre le Laboratoire Charles Coulomb (UMR 5221) et le DIMNP (UMR 5235), nous avons mis en évidence pour la première fois que cette libération se déroule en une fraction de seconde et est le résultat d'une instabilité élastique de la membrane du globule rouge induite par le parasite. Nous avons pu décrire la libération en quatre étapes: i) l'ouverture d'un pore de taille comparable à celle des parasites éjectés (~ 1 micron), ii) la sortie rapide des premiers parasites, puis iii) l'enroulement de la membrane et iv) son flambage qui donne lieu à une libération angulaire efficace des parasites restants. Nous avons rationalisé ce comportement par la présence d'une courbure spontanée dans la membrane du globule rouge infecté induite par le parasite lors de sa croissance et sa multiplication. Par analogie, un bolduc s'enroule de la même manière lorsqu'il est glissé entre une lame de ciseaux et le pouce, ce qui crée une différence d'aire entre les deux faces. Cependant, dans le cas de la membrane du globule rouge infecté, l'origine de la courbure spontanée reste inexpliquée alors que c'est un élément clé de la sortie et une cible potentielle pour des stratégies de contrôle du parasite. Alors que certaines protéines et en particulier des cascades protéolytiques sont déclenchées avant la sortie, leur rôle sur la courbure spontanée n'est pas compris ni mesuré. Des résultats récents de nos équipes montrent cependant l'implication de protéines kinases et phosphatases, ainsi que de protéines parasitaires liées au squelette sous-membranaire du globule rouge infecté. Ce projet de thèse s'appuiera donc sur des outils biologiques déjà développés ou en cours de développement tels que des inhibiteurs spécifiques d'enzymes impliquées dans la sortie des mérozoïtes et de lignées parasitaires mutantes dont le processus de sortie est affecté. Principaux objectifs de la thèse : Nos premières observations sur le choc osmotique appliqué à des GRs sains montrent que la cellule perd son contraste mais pas sa forme sphérique. Ces manipulations préliminaires démontrent qu'il existe une fuite de l'hémoglobine au travers de pores nanométriques qui s'ouvrent et se referment très rapidement à l'opposée de ce que l'on observe dans le cas du paludisme. L'un des premiers objectifs de la thèse sera donc d'étudier les conditions physicochimiques qui peuvent induire une rupture d'enroulement de la membrane d'un globule rouge sain, en induisant une courbure spontanée par différentes voies biochimiques. Une première voie consistera en la modification de la membrane de lipides par adsorption de petites molécules chargées, de polymères flexibles possédant des ancrages hydrophobes spécifiques ou par modification des compositions lipidiques des feuillets de la membrane. Une deuxième voie consistera à modifier l'état mécanique du cytosquelette de spectrine, en induisant son expansion ou sa contraction tout en formant un pore dans la membrane par choc osmotique ou par électroporation. Ce dernier traitement se fera grâce à l'utilisation de ionophores de calcium, de choc de pH ou de modification de la solution saline en utilisant des ions divalents connus pour modifier l'état de stabilité du cytosquelette. L'idée sera de démontrer dans quels cas la membrane peut se déstabiliser en s'enroulant et d'étudier la physique de l'enroulement sous ces différentes conditions. Les observations se feront en caméra rapide au L2C et en microscopie confocale rapide grâce au « spinning disque » récemment acquis au DIMNP. Le second objectif important de la thèse consistera à compléter les études déjà en cours au DIMNP sur l'identification des acteurs moléculaires potentiellement responsables de l'induction de la courbure spontanée. En étudiant l'enroulement de la membrane des GRs infectés avec des inhibiteurs de la sortie ou des mutants pour lesquels l'enroulement est altéré. Nos résultats récents montrent deux étapes dans l'acquisition d'une courbure spontanée par la membrane de l'érythrocyte infecté : une courbure précoce dont la conséquence est la stabilisation d'un pore osmotique et un début d'enroulement, et une courbure tardive permettant l'enroulement complet et le flambage de la membrane nécessaire à la dispersion des parasites. Cette étape tardive dépend de la rupture de la VP et de modifications de protéines associées au squelette sous membranaire de l'érythrocyte. L'objectif de cette partie sera d'utiliser soit une combinaison d'inhibiteurs et de promoteurs de la sortie à différentes étapes en corrélant le comportement de la membrane rompue avec l'état de rupture de la PV, soit des lignées parasitaires mutantes affectées dans le processus de stabilisation du pore ou de son enroulement. Ce travail sera essentiel pour valider les effecteurs parasitaires de la sortie et le modèle, jusqu'à ce jour hypothétique, que nous proposons pour ce processus essentiel au parasite. Un troisième objectif de la thèse, sera de monter une expérience d'extraction de nanotubes de lipides des membranes de globules rouges infectés par micromanipulation capillaire et par pince optique (éléments déjà présents au L2C). L'idée est de disposer d'une mesure en continue et directe de la courbure spontanée en mesurant la force d'extraction d'un tel tube et son évolution temporelle. Bien qu'une telle mesure représente un challenge, si elle est possible, elle permettra d'explorer dynamiquement le rôle des différents acteurs biologiques sur la membrane tout au long du développement du parasite. Notamment nous pourrions explorer l'effet de certaines drogues sur la valeur de cette courbure pour des visées thérapeutiques. Finalement, le dernier objectif de la thèse sera essentiel pour une validation statistique des observations décrites ci-dessus, donc pour la validation d'un modèle, mais également s'inscrit dans une collaboration avec l'entreprise Horiba Medical. En particulier, nous développerons une puce microfluidique par lithographie douce (salle blanche IES), capable de produire une matrice de GRs sains et infectés statiques dans un écoulement contrôlé. Nous pourrons ainsi traiter des GRs simultanément dans les différentes conditions biochimiques décrites précédemment et de voir leurs rôles sur une population de cellule. Une telle puce sera valorisée par l'entreprise pour l'étude de la poration de globules rouges dans des conditions physico-chimiques différentes. En effet, la numération du sang dans les machines d'hématologie développée par Horiba, nécessite la destruction par poration des globules rouges après leur comptage, afin de mesurer la population des globules blancs. Les normes légales actuelles imposent à l'entreprise de modifier la nature des réactifs qu'elle utilise actuellement et demande donc d'étudier cette poration spécifique dans des conditions biens définies. L'obtention d'une bonne statistique est essentielle tout en gardant une résolution du comportement de la membrane à l'échelle cellulaire. Ce que permet l'approche microfluidique.

  • Titre traduit

    Deciphering the mechanism of red blood cell membrane poration and curling and its relevance for the malaria parasite egress.


  • Résumé

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