Toxoplasma gondii, un champion de course et un redoutable envahisseur. Etude des forces motrices et invasives

par Georgios Pavlou

Thèse de doctorat en Chimie Physique Moléculaire et Structurale

Sous la direction de Isabelle Tardieux.

Thèses en préparation à l'Université Grenoble Alpes , dans le cadre de École doctorale chimie et science du vivant , en partenariat avec CRI IAB - Centre de Recherche Epigenetics, Chronic Diseases, Cancer - Institute for Advanced Biosciences (laboratoire) .


  • Résumé

    Toxoplasma gondii est un microorganisme unicellulaire cosmopolite du phylum des Apicomplexa. Ce protozoaire a adopté un mode de vie parasitaire obligatoire et colonise un vaste répertoire d'animaux à sang chaud. Son succès se vérifie chez la population humaine chez laquelle il persiste après une phase aigue et de manière quasi-asymptomatique essentiellement dans les tissus des systèmes nerveux central et périphérique ou dans les muscles. Environ un tiers de la population humaine est ainsi à risque de complications sérieuses de toxoplasmose, essentiellement lors de dysfonctionnements du système immunitaire qui promeuvent une phase de multiplication microbienne non contrôlée. Le stade de développement responsable des dommages tissulaires s'appelle le tachyzoïte. Il s'agit d'une cellule polarisée mesurant plusieurs micromètres, caractérisée par un appareil apical composé de cytosquelettes et de vésicules sécrétoires spécifiques. C'est par son pôle apical que le tachyzoïte pénètre dans la cellule en injectant un complexe protéique qui s'insère dans la membrane plasmique et le cortex de la cellule hôte. Le complexe, considéré ici comme un nanodispositif invasif, définit une interface étroite ou jonction circulaire entre la membrane de la cellule hôte et le tachyzoïte. Cette jonction sert de porte d'entrée mais aussi de point d'ancrage à la force invasive que le parasite doit exercer pour se propulser au sein d'un bourgeon issu de la membrane plasmique hôte. Le travail de thèse documente des propriétés biomécaniques de la cellule tachyzoïte ayant trait au développement des forces exercées par cette dernière pour (i) se déplacer sur des substrats ou au sein de matrices en trois dimensions (3D) selon un mode de glissement ultra rapide, (ii) pénétrer en quelques secondes au sein d'un bourgeon membranaire dans la cellule hôte qui en fin d'invasion s'individualise comme une vacuole abritant le tachyzoïte. La première partie du travail s'appuie sur une combinatoire d'approches en microscopie, avec de la vidéomicroscopie ultra rapide en temps réel, de la mesure de force et de l'analyse des distances entre le substrat et la surface cellulaire, ceci aux échelles nanométrique et de la milliseconde. Les résultats ont mis en évidence l'intégration spatio-temporelle d'une plateforme d'adhésion apicale à partir de laquelle sont générées des forces de traction qui impliquent le système actomyosine du parasite. L'énergie produite par le couple actomyosine conduit à une force de type ressort suite à la torsion et relaxation des microtubules, et rend compte du glissement hélicoïdal à grande vitesse du tachyzoïte. La deuxième partie de la thèse s'appuie sur l'imagerie quantitative à haute vitesse en temps réel et sur un ensemble de lignées cellulaires conçues pour exprimer des marqueurs fluorescents d'intérêt, ainsi qu'à des tests d'invasion innovants conçus pour analyser l'étape d'individualisation de la vésicule d'entrée. Ces approches ont permis d'identifier la rotation particulière du tachyzoïte qui dirige la fermeture du dispositif invasif circulaire favorisant ainsi à la fois l'étanchéité et la libération de la vésicule d'entrée. Cet évènement de fission membranaire se produit en amont du nanodispositif et est indépendante des mécanoenzymes dynamines des cellules hôtes, une famille de protéines principalement impliquée dans la naissance des endosomes. L'ensemble des données étaye l'idée que le tachyzoïte a développé un nanodispositif invasif multifonctionnel qui, associé au torque final, imite l'activité de fission des dynamines. Enfin, la visualisation d'une réorganisation rapide des marqueurs de la membrane plasmique post-torsion a permis de proposer que celle-ci puisse également agir comme signal mécanique pour opérer la transition du mode de vie extracellulaire à celui intracellulaire. Les concepts et techniques introduits dans cette thèse pourront servir de base pour des études futures sur le comportement mobile et invasif de T.gondii.

  • Titre traduit

    Toxoplasma gondii, a super fast runner and cell invader. Studying motion and forces


  • Résumé

    Toxoplasma gondii is a cosmopolite obligate intracellular Apicomplexa parasite that infects a wide repertoire of warm-blooded animals and virtually all nucleated cells. About a third of the human population carries the persistent stage of T. gondii, and is known at risk for life-threatening toxoplasmosis in case of immune-dysfunction. The invasiveness of the T. gondii tachyzoite developmental stage is a key determinant for expansion of the parasite population and accounts for the initiation of acute tissue damages associated with the disease. The tachyzoite is a several micrometer size bow-shaped cell that displays a robust polarity and is equipped with a typical apical apparatus made of cytoskeletal arrangements and specific secretory vesicles. With these attributes, the tachyzoite contact the host cell surface with the apical side and enters within a second time-scale into a budding entry vesicle by injecting a protein complex into and beneath the facing plasma membrane. The complex, seen here as an invasive nanodevice, defines a tight zoite-cell interface that bridges both cells through a circular junction. This tight Zoite-Cell Junction (ZCJ) serves therefore as a door of entry but also as an anchor point to withstand the parasite invasive force required to actively enter the host cell. In addition, its tightness acts as a molecular sieve to select for components from the plasma membrane able to flow into the budding entry vesicle. The PhD thesis brings new insights on the forces underlying (i) the peculiar mode of locomotion called helical gliding of free tachyzoite (ii) the host cell invasion event in particular at the end of the process thereby introducing conceptual and experimental biophysics framework. The first part combines high-speed quantitative live microscopy with force microscopy and Reflection Interference Contrast Microscopy and use micropatterning. These quantitative approaches have allowed unveiling the spatiotemporal integration of a unique polar anchoring adhesion and the traction-spring-torque triad forces that set the Toxoplasma thrust force required for high-speed helical gliding. The second part of the PhD relies on the quantitative high speed live imaging and on a set of both parasite and host cell lines engineered to express fluorescent markers of interest, in particular related to the ZCJ element, together with innovative invasion assays designed to monitor in detail the poorly documented pinching off step of the budding entry vesicle. Indeed this membrane fission event promotes the birth of a bona fidae sub-cellular compartment enclosing the tachyzoite, and further remodeled to support parasite growth. These approaches have allowed identifying the peculiar rotation of the tachyzoite along the long axis which imposes a twisting motion on the parasite basal pole and directs closure of the circular invasive device therefore promoting both sealing and release of the entry vesicle. Importantly membrane fission occurs upstream the site of the nanodevice insertion and is independent of the host cell mechanoenzymes dynamins, a protein family primarily involved in pinching off of the endocytic pits and thus in endosome birth. Overall, the work supports the view that the tachyzoite has evolved a multifunction invasive nanodevice, which together with the final torque mimics the fission activity of the dynamins. Finally, monitoring distinct host cell plasma markers and their rapid reorganization upon the tachyzoite twist allowed proposing that the latter could also act as an initial mechanical trigger for the transition to the intracellular lifestyle. In conclusion, this PhD work has succeeded in implementing new biophysics-based concepts and techniques to start unraveling the biomechanics of the T. gondii tachyzoite, in particular in the context of essential behaviors including (i) the navigation on 2D and within 3D substrates and (ii) the host cell invasion process.