Développement d’un test sanguin pour le dépistage de la maladie d’Alzheimer

Development of a blood screening test for Alzheimer’s disease

• Auteur / Autrice : Fanny De Torres
• Direction : Dulcé Papy-Garcia
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie cellulaire et moléculaire
• Date : Soutenance le 17/06/2022
• Etablissement(s) : Paris 12
• Ecole(s) doctorale(s) : Ecole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Croissance cellulaire, Réparation et Régénération Tissulaire (Créteil)
• Jury : Président / Présidente : Fouad Lafdil
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Dulcé Papy-Garcia, Angela Sutton, Patrick Pierre Michel, Arnaud Bruneel, Francis Vacherot
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Angela Sutton, Patrick Pierre Michel

Mots clés

Mots clés contrôlés

Dépistage

Alzheimer, Maladie d'

Mots clés libres

Maladie d'Alzheimer

Diagnostic sanguin

Macrophages

Héparanes sulfate 3-O-Sulfatés

Alzheimer’s disease

Blood diagnosis

Macrophages

3-O-Sulphated heparan sulphates

Résumé

La maladie d’Alzheimer (MA), forme de démence la plus commune chez les personnes âgées, se caractérise par la présence dans le cerveau de plaques amyloïdes composées d’agrégats de peptides amyloïde bêta (Abêta) et de dégénérescences neurofibrillaires, constituées d’amas de protéines Tau anormalement phosphorylées (tauopathie). Actuellement, le diagnostic le plus efficace de la MA repose essentiellement sur la mise en évidence de ces deux types de lésions cérébrales par imagerie TEP des plaques amyloïdes et par dosages biochimiques de Tau et Abêta dans le liquide céphalo-rachidien prélevé par ponction lombaire. Ces deux types d’examens, coûteux et invasifs, ne sont pas applicables à un dépistage dans la population générale. Ainsi, bien que ces biomarqueurs de la MA soient détectables dès le stade asymptomatique, le diagnostic de cette maladie n’est posé que tardivement. Les héparanes sulfate, polysaccharides physiologiquement exprimés à la surface cellulaire et dans la matrice extracellulaire, constituent un autre type de biomarqueur de la MA précocement accumulé au niveau des plaques amyloïdes et des dégénérescences neurofibrillaires. Les précédents résultats du laboratoire ont précisé la nature 3-O-sulfatée de ces héparanes sulfate (3S-HS) dans des neurones modèles de tauopathie avec une implication de l’enzyme de biosynthèse héparane sulfate 3-O-sulfotransférase 2 (HS3ST2) dans la génération de la tauopathie. La forte expression de cette enzyme neuronale a également été démontrée in vitro dans un autre type cellulaire, les macrophages dérivés en culture primaire des monocytes sanguins humains. Le développement d’un test sanguin basé sur l’hypothèse selon laquelle les 3S-HS, en particulier ceux générés par la HS3ST2, pourraient constituer un biomarqueur précoce de la MA détectable dans les macrophages, a ainsi été initié. Les objectifs de ce travail de thèse étaient : 1) de développer une méthode de diagnostic fiable et la plus industrialisable possible (recherche appliquée) et 2) d’évaluer les 3S-HS comme biomarqueur potentiel de la MA dans les macrophages ainsi que d’autres pistes diagnostiques (recherche fondamentale). Après avoir confirmé et caractérisé les expressions de la HS3ST2 et des 3S-HS dans les macrophages humains, les différentes étapes du protocole de recherche initial utilisé pour étudier l’expression des 3S-HS dans ces cellules ont été optimisées permettant la simplification, la réduction du temps et du coût de réalisation, l’amélioration de la standardité, de la reproductibilité et des performances du protocole d’analyse des cultures de macrophages. Grâce à ce protocole optimisé et à une nouvelle méthode d’analyse automatique des cellules, nous avons pu mettre en évidence une expression différentielle des 3S-HS dans les macrophages des patients atteints de la MA pouvant constituer un biomarqueur d’intérêt de la MA. En explorant d’autres pistes diagnostiques, nous avons également mis en avant le caractère prometteur du morphotype des macrophages en tant que biomarqueur de la MA. L’apport d’une analyse génotypique simple des SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) associés à la MA a également été évaluée. En somme, ces travaux ont permis le développement d’une méthode optimisée et plus industrialisable d’obtention et d’analyse des cultures de macrophages utilisable non seulement pour évaluer l’expression des 3S-HS mais également pour d’autres applications. L’ensemble des résultats de cette thèse ont permis d’ouvrir la voie à de nouvelles stratégies de diagnostic et de compréhension de la MA basées sur les macrophages périphériques.

Alzheimer's disease (AD), the most common form of dementia in the elderly, is characterized by the presence in the brain of amyloid plaques composed of aggregates of amyloid beta peptides (Abeta) and neurofibrillary tangles, composed of aggregates of abnormally phosphorylated Tau proteins (tauopathy). Currently, the most effective diagnosis of AD is based essentially on the identification of these two types of brain lesions by PET imaging of amyloid plaques and by biochemical assays of Tau and Abeta in cerebrospinal fluid collected by lumbar puncture. These two types of examination are expensive and invasive and are not applicable to screening in the general population. Thus, although these AD biomarkers can be detected as early as the asymptomatic stage, the diagnosis of this disease is only made late. Another type of AD biomarker that accumulates early in amyloid plaques and neurofibrillary tangles is heparan sulphate, a polysaccharide physiologically expressed on the cell surface and in the extracellular matrix. Previous results from the laboratory have specified the 3-O-sulphated nature of these heparan sulphates (3S-HS) in neuronal models of tauopathy with an involvement of the biosynthetic enzyme heparan sulphate 3-O-sulphotransferase 2 (HS3ST2) in the generation of the tauopathy. The high expression of this neuronal enzyme has also been demonstrated in vitro in another cell type; macrophages derived in primary culture from human blood monocytes. The development of a blood test based on the hypothesis that 3S-HS, in particular generated by HS3ST2, could constitute an early biomarker of AD detectable in macrophages, was thus initiated. The objectives of this thesis work were: 1) to develop a reliable and most industrializable diagnostic method (applied research) and 2) to evaluate 3S-HS as a potential biomarker of AD in macrophages as well as other diagnostic approaches (basic research). After confirming and characterizing HS3ST2 and 3S-HS expression in human macrophages, the different steps of the research protocol initially used to study 3S-HS expression in these cells were optimized, allowing simplification, reduction of time and cost, improvement of standardization, reproducibility, and performance of the macrophage culture analysis protocol. Using this optimized protocol and a new automated cell analysis method, we were able to identify differential expression of 3S-HS in macrophages from AD patients as a potential biomarker of interest in AD. By exploring other diagnostic approaches, we have also highlighted the macrophage morphotype as a promising biomarker for AD. The contribution of a simple genotypic analysis of SNPs (Single Nucleotide Polymorphisms) associated with AD was also evaluated. In sum, this work has allowed the development of an optimized and more industrializable method for obtaining and analyzing macrophage cultures that can be used not only to assess the expression of 3S-HS but also for other applications. The results of this thesis have opened the way to new strategies for diagnosing and understanding AD based on peripheral macrophages.