Modéles murins de cellules souches embryonnaires pour explorer des mécanismes épigénétiques dans des maladies.

Mouse embryonic stem cell models to explore epigenetic mechanisms involved in human disease.

• Auteur / Autrice : Sabina Farhadova
• Direction : Robert Feil, Amiraslanov AHLIman
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Inscription en doctorat le ; Soutenance le 09/06/2022
• Etablissement(s) : Université de Montpellier (2022-….) en cotutelle avec Azerbiajan Medical University
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : IGMM - Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier
• Partenaire(s) de recherche : Equipe de recherche : Empreinte génomique et développement
• Jury : Président / Présidente : Laurent Journot
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Robert Feil, Philippe Arnaud, Irene Netchine, Jérôme CAVAILLé, Jean-Christophe Andrau
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Philippe Arnaud, Irene Netchine

Mots clés

Mots clés libres

Développement

Cellule souche

Épigénétique

Empreinte génomique

Development

Stem cell

Epigenetic

Genomic imprinting

Résumé

L'empreinte génomique a un rôle essentiel dans le développement des mammifères ainsi que dans leurs maladies. Le domaine Dlk1-Dio3, essentiel au développement, est l'un des rares locus imprimé régulé par une région de contrôle d’empreinte de méthylation paternelle, appelée IG-DMR. Dans ce domaine, les gènes codant pour les protéines (Dlk1, Rtl1 et Dio3) sont exprimés à partir du chromosome paternel et les ARN non codants (Meg3, Rtl1as, Rian et Mirg) du chromosome maternel. Sur le chromosome maternel, l'IG-DMR non méthylé agit comme un activateur qui contrôle l'expression de Meg3, Rtl1as, Rian et Mirg, tous exprimés à partir d'un seul polycistron. Une autre région différentiellement méthylée (DMR) comprend le promoteur Meg3 et le premier intron et exon. Ce DMR est également méthylé sur le chromosome paternel, ce qui empêche l'expression des ARN non codants. Chez l'homme, les événements de perte de méthylation (LOM) au niveau du domaine DLK1-DIO3 peuvent entra îner des troubles de la croissance fœtale comme observé dans le syndrome de Temple, dont l'étiologie moléculaire reste mal connue. Mon projet de thèse a abordé le rôle du Meg3 DMR, et celui de l'ARNlnc Meg3, dans l'expression des gènes imprimés au domaine Dlk1-Dio3. Dans mes études, j'ai utilisé les cellules WT et les cellules souches embryonnaires hybrides (épi)génétiquement modifiées comme un modèle d’étude. Afin d'imiter la perte d'événements de méthylation au niveau du domaine Dlk1-Dio3, j'ai adapté une technologie transitoire basée sur CRISPR-dCas9 qui recrute plusieurs copies du domaine catalytique de TET1 sur des séquences cibles. Plusieurs clones ont été obtenus dans lesquels les marques de méthylation n'étaient plus présentes au niveau du promoteur Meg3 du chromosome paternel. L’induction de LOM conduit à l’activation de tous les ARNnc présent sur le chromosome paternel. Il est important de noter que nous avons également observé une réduction significative du niveau d'expre ssion du gène de signalisation notch Dlk1, en conséquence l'expression biallélique de Meg3. De plus, j’ai partiellement contribué dans l'exploration des lignées ESC dans lesquelles nous avons induit l'expression d'ARNlnc tronqués suite à l’insertion d'un signal p(A). Ces études confirment l'importance de Meg3 ARNlnc dans l'expression imprimée de Dlk1. Ces données ont apporté des informations mécanistiques essentielles, notamment l'expression d'ARNlnc bialléliques induite par LOM au niveau du domaine Dlk1-Dio3 entraîne une « perte d’empreinte » au niveau du gène Dlk1 essentiel pour le développement.

Genomic imprinting plays an essential role in mammalian development and disease. The developmentally essential Dlk1-Dio3 domain is one of the few imprinted loci regulated by a paternally methylated imprinting control region, called the IG-DMR. In this domain, protein-coding genes (Dlk1, Rtl1, and Dio3) are expressed from the paternally inherited chromosome and non-coding RNAs (Meg3, Rtl1as, Rian, and Mirg) from the maternally inherited chromosome. On the maternal chromosome, the unmethylated IG-DMR acts as an enhancer that controls the expression of Meg3, Rtl1as, Rian, and Mirg, all expressed from a single polycistron. Another differentially methylated region (DMR) comprises the Meg3 promoter and its first intron and exon. This DMR is methylated on the paternal chromosome as well, preventing the expression of the non-coding RNAs from the paternally inherited chromosome. In humans, loss of methylation (LOM) events at the DLK1-DIO3 domain can lead to an imprin ting disorder (ID) named Temple Syndrome, whose molecular aetiology remains poorly understood. My Ph.D. project has addressed the role of the Meg3 DMR, and that of the Meg3 lncRNA, in the imprinted gene expression at Dlk1-Dio3. In my studies, I used WT and (epi)genetically edited hybrid embryonic stem cells ‘ESCs’ as model systems. Particularly, in order to mimic loss of methylation events at the Dlk1-Dio3 domain, I adapted a transient CRISPR-dCas9-based technology that recruits multiple copies of TET1-catalytic domain to selected target sequences. Several clones were obtained in which methylation marks were no longer present at the Meg3 promoter on the paternal chromosome. The induced LOM led to activation of all the ncRNAs on the paternal chromosome. Importantly, we observed a significant reduction in the expression level of the notch signaling gene Dlk1 as well, as a consequence of the biallelic Meg3 expression. I also made a partial contribution to the exploration of ESC lines in which we induced expression of truncated lncRNA by insertion of a p(A) signal. These studies confirm the likely importance of Meg3 lncRNA in Dlk1 imprinted gene expression. Combined, this Ph.D. research has brought essential mechanistic insights, including that LOM-induced biallelic lncRNA expression at the Dlk1-Dio3 domain leads to ‘loss of imprinting’ at the developmentally essential Dlk1 gene.