Détermination de la composition primaire (acides gras) des glycérolipides par techniques séparatives couplées à la spectrométrie de masse haute résolution.

par Sonia Abreu

Projet de thèse en Chimie

Sous la direction de Pierre Chaminade.

Thèses en préparation à université Paris-Saclay , dans le cadre de École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes , en partenariat avec Lipides : Systèmes analytiques et biologiques (laboratoire) et de Faculté des sciences d'Orsay (référent) depuis le 15-12-2018 .


  • Résumé

    Titre: Détermination de la composition primaire (acides gras) des glycérolipides par techniques séparatives couplées à la spectrométrie de masse haute résolution. Structure d'Accueil : EA7357 Lipides, systèmes analytiques et biologiques. Lip(Sys)² Directeur de Thèse : Pierre Chaminade Thématique : Analyse lipidomique et caractérisation des échantillons lipidiques complexes. Domaine : Analyse des lipides par LC/HRMS. Contexte L'évaluation de la composition détaillée des acides gras portés par différentes classes lipidiques est d'un intérêt majeur pour la compréhension et la mise en évidence de différents processus métaboliques et/ou dans un contexte plus simple pour établir le profil caractéristique de certains corps gras. Les applications concernent d'une part l'analyse lipidomique(1), ou l'incorporation des acides gras dans les voies métaboliques peut être mise en évidence par l'analyse de classes lipidiques. D'autre part la caractérisation ou « analyse fine » de corps gras, qui apportent une réponse à l'évaluation du caractère alimentaire (et de l'intérêt nutritionnel) (2) de certaines huiles végétales et/ou le contrôle de leur adultération(3). L'analyse quantitative des lipides dans un échantillon complexe est rendue difficile par le grand nombre d'espèces à quantifier. En effet, même si le couplage des techniques séparatives (essentiellement en phase liquide) à la spectrométrie de masse haute résolution apporte une réponse appropriée à l'identification des différentes classes lipidiques et des espèces moléculaires qui les composent, l'aspect quantitatif renferme de nombreux défis analytiques(4) Objectif : L'objectif de ce travail de thèse est de développer une approche semi-quantitative de la composition en acides gras des espèces moléculaires de classes lipidiques incorporant le glycérol (glycérolipides). Une approche classique et largement répandue (5) consiste à réaliser une hydrolyse des acides gras et une méthylation simultanée qui permet une analyse par chromatographie en phase gazeuse des esters méthyliques (FAMES) ainsi formés. Cette approche permet une caractérisation détaillée des acides gras mais nécessite un fractionnement préalable de l'échantillon quand différentes classes lipidiques sont présentes simultanément. Cette technique est robuste, bien documentée mais aussi longue et fastidieuse quand l'échantillon est complexe. Par son principe, elle présente le défaut de cliver la classe lipidique étudiée et supprime donc toute information de régiospécificité des substitutions de la partie polaire de la molécule. L'analyse quantitative des espèces lipidiques d'une classe, telle que l'on peut les observer par LC/HRMS, parait d'autant plus intéressante qu'elle conserve l'intégrité des espèces lipidiques étudiées. Cependant, comme indiqué précédemment, l'analyse quantitative des lipides est complexe. Deux approches sont actuellement utilisées (4): d'une part, l'utilisation d'étalons internes et, d'autre part, la quantification relative. L'une et l'autres de ces approches représentent une tentative de réponse au fait que les espèces moléculaires d'une même classe de lipides peuvent présenter des caractéristiques d'ionisation et de fragmentation notablement différentes. Par exemple, avec les sources d'ionisation à pression atmosphériques, dans le cas des triglycérides ou le glycérol est estérifié par 3 acides gras, le pic de base correspond à l'ion [M+H-(RCOOH)]+ pour les espèces moléculaires comprenant des chaines saturées (le [M+H]+ n'est pas observé) alors que la présence d'un ou plusieurs acides gras polyinsaturés augmentent l'intensité de l'ion [M+H]+ qui peut représenter l'ion majoritaire de celles-ci. Il y a donc une nécessité absolue de tenir compte des caractéristiques d'ionisation de chaque espèce de lipide constituante d'une classe lors de l'analyse quantitative (6). L'approche quantitative par dilution isotopique, ou plus généralement par étalonnage interne, ne peut être mise en œuvre avec autant de standards qu'il y a d'espèces moléculaires de lipides dans l'échantillon. La disponibilité commerciale des standards est très faible au regard du nombre d'espèces potentiellement présentes. En conséquence, des facteurs de correction doivent être calculés pour relier quantitativement les principales espèces moléculaires et le (les) standard(s) interne(s). Il s'agit donc d'une approche particulièrement lourde en termes de calibrage et qui ne peut être envisagée que pour les espèces moléculaires dont les standards sont disponibles. L'approche par quantification relative est principalement utilisée dans les approches omiques. Elle consiste à comparer l'intensité des ions issus des différentes espèces moléculaires obtenues dans différentes groupe d'échantillons. Il s'agit donc d'une mesure différentielle de l'accroissement ou de la diminution des espèces dans les groupes d'échantillons. Cette mesure différentielle basée sur l'intensité de réponse des ions présente l'avantage de s'affranchir des différences d'ionisation inter-espèces. Elle n'aboutit cependant pas à une quantification au sens strict mais présente un intérêt certain pour la mise en évidence de biomarqueurs qui pourront ensuite (et en nombre limité) être quantifiés par l'approche précédente. Nous nous sommes déjà intéressés à la problématique de l'ionisation des espèces de glycerophospholipides dans les conditions de chromatographie en phase normale (7). Nous avons, à cette occasion, montré que la coélution des espèces générait des phénomènes d'interdépendance quant à leur ionisation. De ce fait, une prise en compte des spécificités d'ionisation propre à chaque espèce de glycéro(phospho)lipide ainsi que des compétitions inter-espèces vis-à-vis de leur ionisation semble particulièrement complexe. Cette complexité est augmentée par le fait que les espèces présentes ne sont pas connues à priori. Il existe donc une nécessité de développer une approche plus simple, intermédiaire entre l'étalonnage interne des espèces des différentes classes lipidiques et l'analyse des acides gras après fractionnement et méthylation. Cette possibilité est offerte par la séparation des différentes classes lipidiques par chromatographie en phase normale et le couplage à la HRMS. Nous avons récemment publié une méthode chromatographique (8) qui permet la mise en évidence de nombreuses classes ou sous classes lipidiques. Le couplage via l'interface APPI montre un rapport signal sur bruit favorable pour la très grande majorité de ces classes lipidiques. Si l'on se restreint au glycérolipides (et possiblement aux glycérophospholipides), l'examen de la fragmentation en MS² ou MS3 donne des indications sur la nature des acides gras substituant le glycérol. Des travaux préliminaires suggèrent que l'intensité des ions correspondants est intrinsèquement moins variable que celle des ions parents évoqués précédemment. C'est cette constatation expérimentale qui est à la base du sujet de thèse que nous souhaitons développer. Nous nous proposons de développer une approche semi quantitative de la composition en acides gras des classes des glycérolipides. Ces classes lipidiques correspondent principalement aux mono-, di- et triglycérides ainsi qu'aux glycérophospholipides. Les principales étapes consisteront : 1- A s'intéresser dans un premier temps exclusivement à la classe des triacylglycérols. Ceux-ci sont les composants quasi exclusifs des huiles végétales dont l'intérêt nutritionnel est largement reconnu. Les travaux (déjà initiés) seront conduits en injection directe (FIA) et en couplage (avec la méthode déjà évoquée). L'objectif est d'obtenir directement par LC/HRMS la composition en FA des huiles sans recours à une étape d'hydrolyse et dérivation les amenant à la GC. 2- A étendre cette approche aux autres classes de glycérolipides (mono et diglycérides) ainsi que, si possible aux classes des glycérophospho et glycéroglyco lipides. 3- A chercher à associer les informations de régiosélectivité des substitutions disponibles dans les spectres de fragmentation des glycérolipides aux résultats précédents pour offrir une description plus complète des espèces moléculaires présentes dans l'échantillon. Ce travail s'inscrit dans les problématiques du pôle « Lipidomique, outils, concepts, méthodes » de notre Unité Interdisciplinaire. Comme indiqué, le travail décrit précédemment est déjà initié par des résultats obtenus par Sonia ABREU, assistante ingénieure dans le cadre des activités de recherche qu'elle mène dans le laboratoire, sous ma direction. Ce projet de thèse a pour objectif de concrétiser cette activité de recherche par la préparation d'une Thèse d'Université. C'est donc cette seule et unique candidature qui sera proposée pour ce projet doctoral. Financement du projet doctoral. Le sujet de thèse présenté ici est destiné à permettre à Mme Sonia ABREU de réaliser une Thèse d'Université sur les travaux qu'elle mène dans notre équipe. Sonia ABREU est assistante ingénieure dans notre laboratoire depuis 2008. Le projet de thèse s'inscrit dans son activité professionnelle quotidienne. Suite à la réunion que nous avons sollicité le 11 octobre 2018, la Directrice du service du personnel de même que la Déléguée de la directrice générale des services de l'UFR Pharmacie où S. Abreu est affectée nous ont toutes deux donné leur accord de principe quand a la compatibilité de son emploi d'AI et la réalisation d'une thèse. Bibliographie (1) Rustam, Yepy H., et Gavin E. Reid. « Analytical Challenges and Recent Advances in Mass Spectrometry Based Lipidomics ». Analytical Chemistry 90, no 1 (2 janvier 2018): 374 97. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b04836. (2) Orsavova, Jana, Ladislava Misurcova, Jarmila Vavra Ambrozova, Robert Vicha, et Jiri Mlcek. « Fatty Acids Composition of Vegetable Oils and Its Contribution to Dietary Energy Intake and Dependence of Cardiovascular Mortality on Dietary Intake of Fatty Acids ». International Journal of Molecular Sciences 16, no 6 (5 juin 2015): 12871 90. https://doi.org/10.3390/ijms160612871. (3) Peng, Dan, Yanlan Bi, Xiaona Ren, Guolong Yang, Shangde Sun, et Xuede Wang. « Detection and quantification of adulteration of sesame oils with vegetable oils using gas chromatography and multivariate data analysis ». Food Chemistry 188 (1 décembre 2015): 415 21. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.05.001. (4) Murphy, Robert C. « Challenges in mass spectrometry-based lipidomics of neutral lipids ». TrAC Trends in Analytical Chemistry 107 (1 octobre 2018): 91 98. https://doi.org/10.1016/j.trac.2018.07.023. (5) Seppänen-Laakso, T, I Laakso, et R Hiltunen. « Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition ». Analytica Chimica Acta, CHROMATOGRAPHY OF FATTY ACIDS, 465, no 1 (16 août 2002): 39 62. https://doi.org/10.1016/S0003-2670(02)00397-5. (6) Han, Xianlin, et Richard W. Gross. « Quantitative Analysis and Molecular Species Fingerprinting of Triacylglyceride Molecular Species Directly from Lipid Extracts of Biological Samples by Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry ». Analytical Biochemistry 295, no 1 (1 août 2001): 88 100. https://doi.org/10.1006/abio.2001.5178. (7) Khoury, Spiro, Nadine El Banna, Sana Tfaili, et Pierre Chaminade. « A Study of Inter-Species Ion Suppression in Electrospray Ionization-Mass Spectrometry of Some Phospholipid Classes ». Analytical and Bioanalytical Chemistry 408, no 5 (1 février 2016): 1453 65. https://doi.org/10.1007/s00216-015-9245-6. (8) Abreu, Sonia, Audrey Solgadi, et Pierre Chaminade. « Optimization of normal phase chromatographic conditions for lipid analysis and comparison of associated detection techniques ». Journal of Chromatography A 1514 (8 septembre 2017): 54 71. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2017.07.063.

  • Titre traduit

    Primary composition (Fatty Acids) of glycerolipids assessment by mean of separative techniques coupled to high resolution mass spectrometry


  • Résumé

    Title: Determination of the primary composition (fatty-acids) of the glycerolipides by separative techniques coupled with the high-resolution mass spectrometry. Research Unit: EA7357 Lipids, systems analytical and biological. Lip (Sys) ² Supervisor: Pierre Chaminade Thematics: Lipidomic analysis and characterization of the complex lipidic samples. Field: Analysis of the lipids by LC/HRMS. Context The evaluation of the detailed composition of the fatty-acids carried by various lipid classes is of a major interest for comprehension and the description of various metabolic processes and/or in a simpler context to establish the profile characteristic of certain fats. The applications relate to on the one hand the lipidomic analysis (1), or the incorporation of the fatty-acids in the metabolic ways can be put in obviousness by the analysis of lipid classes. In addition the characterization of fats, which give an answer to the evaluation of the food character and nutritional interest (2) of certain vegetable oils and/or the control of their adulteration (3). The quantitative analysis of the lipids in a complex sample is made difficult by a large number of species to be quantified. Indeed, even if the coupling of the separative techniques (primarily in liquid phase) to the mass spectrometry high-resolution gives an appropriate response to the identification of the various lipid classes and molecular species which compose them, the quantitative aspect contains many analytical challenges (4) Objective: The objective of this work of thesis is to develop a semi-quantitative approach of the composition in fatty-acids of the molecular species of lipid classes incorporating glycerol or glycerolipides. A classical and largely widespread approach (5) consists in carrying out a simultaneous hydrolysis and methylation of fatty acids which allows their analysis by gas chromatography (FAME). This approach allows a detailed characterization of the fatty-acids but requires a preliminary fractionation of the sample when various lipidic classes are present simultaneously. This technique is robust and well documented but also long and tiresome when the sample is complex. By its principle, it presents the defect to cleave the studied lipidic class and thus removes any information of regiospecificity of substitutions of the polar part of the molecule. The quantitative analysis of the lipid species of a class, such as one can observe them by LC/HRMS, appears all the more interesting as it preserves the integrity of the studied lipid species. However, as indicated previously, the quantitative analysis of the lipids is complex. Two approaches are currently used (4): on the one hand, the use of internal standards and, on the other hand, the relative quantification. One and the others of these approaches represent an attempt at answer to the fact that the molecular species of the same class of lipids can show characteristics of notably different ionization and fragmentation. For example, with atmospheric pressure ionization sources, in the case of triglycerides where glycerol is esterified by 3 fatty-acids, the base peak corresponds to the ion [M+H-(RCOOH)]+ for the molecular species including saturated chains ( [M+H] + is not observed) whereas the presence of one or more polyunsaturated fatty-acids increase the intensity of the ion [M+H] + which can represent the majority ion of those. There is thus an absolute necessity to take account of the characteristics of ionization of each constituent species of lipid of a class during the quantitative analysis (6). The quantitative approach by isotopic dilution, or more generally by internal calibration, cannot implemented with as many standards as there are molecular species of lipids in the sample. The commercial availability of the standards is very low taking into consideration number of species potentially present. Consequently, correction factors must be calculated quantitatively to connect the principal molecular species and internal standard (s). It is thus a particularly heavy approach in term of calibration and which can be considered only for the molecular species whose standards are available. The approach by relative quantification is mainly used in the omic approaches. It consists in comparing the intensity of the ions resulting from the various molecular species obtained in different samples groups. It is thus a differential measurement the increase or reduction in the species in the groups of samples. This differential measurement based on the intensity of response of the ions has the advantage of being freed from the differences in ionization inter-species. It does not lead however to a quantification in a strict sense but is of unquestionable interest for the description of biomarkers which could then (and of limited number) be quantified by the previous approach. We were already interested in the problems of ionization of the species of glycerophospholipides under the conditions of normal phase chromatography (7). On this occasion, we showed that the species co-elution generated interdependence phenomena as for their ionization. So a taking into account of specificities of specific ionization to each species of glycero (phospho) lipid as of the competitions inter-species with respect to their ionization seems particularly complex. This complexity is increased by the fact that the species present are not known a priori. There is a need for developing a simpler approach, intermediary between the internal calibration of the species of different classifies lipid and analyzes fatty-acids after fractionation and methanolysis. This opportunity is given by the separation of the various lipid classes by chromatography in normal phase and the coupling to the HRMS. We recently published a chromatographic method (8) which allows the description of many classes or under lipid classes. The coupling via the API interface shows a signal report on noise favorable for the very majority of these lipidic classes. If one restricts oneself with the glycerolipides (and possibly with the glycerophospholipides), the examination of fragmentation in MS ² or MS3 gives indications on the nature of the fatty-acids substituent the glycerol. Preliminary work suggests that the intensity of the corresponding ions is intrinsically less variable than that of the ions parents evoked previously. It is this experimental observation which is at the base of the subject of thesis that we wish to develop. We propose to develop a quantitative semi approach of the composition in fatty-acids of the classes of the glycerolipides. These lipid classes correspond mainly to mono, say and triglycerides like to the glycerophospholipides. The principal stages will consist in: 1 With being interested initially exclusively in the class of the triacylglycerols. Those are the nearly exclusive components of vegetable oils whose nutritional interest is largely recognized. The works (already initiated) will be carried in direct injection (TRUSTED) and coupling (with the already evoked method). The objective is to obtain directly by LC/HRMS the composition in F of oils without recourse to a stage of hydrolysis and derivation bringing them to the GC. 2 To extend this approach to the other classes of glycerolipides (mono and diglycérides) like, if possible with the classes of the glycerophospho and glyceroglyco lipids. 3 To seek to associate information of regioselectivity of substitutions available in the spectra of fragmentation of glycerolipides (ref.) to the previous results to offer a more complete description of the molecular species present in the sample. This work falls under the scope of the pole “Lipidomique, tools, concepts, methods” of our Interdisciplinary Unit. As indicated, work describes previously is already initiated by results got by Sonia ABREU, assistant ingénieure within the framework of the research activities which she undertakes in the laboratory, under my direction. This project of thesis aims to concretize this research activity by the preparation of a Thesis of University. It is thus this only and single candidature which will be proposed for this doctoral project. Financing of the doctoral project. The subject of thesis presented here is intended to make it possible to Mrs. Sonia ABREU to carry out a Thesis of University on the works which she undertakes in our team. Sonia ABREU is “assistant ingénieure” in our laboratory since 2008. The project of thesis falls under its daily occupation. Following a meeting organized at our demand on October 11th, 2018, the Director of the personnel department and the Deputy one of the chief executive officer of the services of the UFR Pharmacy where S. Abreu is affected have us both given their agreement in principle when has the compatibility of its use of AI and the realization of a thesis. Bibiography (1) Rustam, Yepy H., et Gavin E. Reid. « Analytical Challenges and Recent Advances in Mass Spectrometry Based Lipidomics ». Analytical Chemistry 90, no 1 (2 janvier 2018): 374 97. https://doi.org/10.1021/acs.analchem.7b04836. (2) Orsavova, Jana, Ladislava Misurcova, Jarmila Vavra Ambrozova, Robert Vicha, et Jiri Mlcek. « Fatty Acids Composition of Vegetable Oils and Its Contribution to Dietary Energy Intake and Dependence of Cardiovascular Mortality on Dietary Intake of Fatty Acids ». International Journal of Molecular Sciences 16, no 6 (5 juin 2015): 12871 90. https://doi.org/10.3390/ijms160612871. (3) Peng, Dan, Yanlan Bi, Xiaona Ren, Guolong Yang, Shangde Sun, et Xuede Wang. « Detection and quantification of adulteration of sesame oils with vegetable oils using gas chromatography and multivariate data analysis ». Food Chemistry 188 (1 décembre 2015): 415 21. https://doi.org/10.1016/j.foodchem.2015.05.001. (4) Murphy, Robert C. « Challenges in mass spectrometry-based lipidomics of neutral lipids ». TrAC Trends in Analytical Chemistry 107 (1 octobre 2018): 91 98. https://doi.org/10.1016/j.trac.2018.07.023. (5) Seppänen-Laakso, T, I Laakso, et R Hiltunen. « Analysis of fatty acids by gas chromatography, and its relevance to research on health and nutrition ». Analytica Chimica Acta, CHROMATOGRAPHY OF FATTY ACIDS, 465, no 1 (16 août 2002): 39 62. https://doi.org/10.1016/S0003-2670(02)00397-5. (6) Han, Xianlin, et Richard W. Gross. « Quantitative Analysis and Molecular Species Fingerprinting of Triacylglyceride Molecular Species Directly from Lipid Extracts of Biological Samples by Electrospray Ionization Tandem Mass Spectrometry ». Analytical Biochemistry 295, no 1 (1 août 2001): 88 100. https://doi.org/10.1006/abio.2001.5178. (7) Khoury, Spiro, Nadine El Banna, Sana Tfaili, et Pierre Chaminade. « A Study of Inter-Species Ion Suppression in Electrospray Ionization-Mass Spectrometry of Some Phospholipid Classes ». Analytical and Bioanalytical Chemistry 408, no 5 (1 février 2016): 1453 65. https://doi.org/10.1007/s00216-015-9245-6. (8) Abreu, Sonia, Audrey Solgadi, et Pierre Chaminade. « Optimization of normal phase chromatographic conditions for lipid analysis and comparison of associated detection techniques ». Journal of Chromatography A 1514 (8 septembre 2017): 54 71. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2017.07.063.