Etude des rôles des Poly(ADP-ribose) polymérases d'Arabidopsis dans la modification covalente de terminaisons des cassures de brins d'ADN in vitro et in vivo.

par Aigerim Kuanbay

Projet de thèse en Aspects moléculaires et cellulaires de la biologie

Sous la direction de Murat Saparbaev et de Alexander Ishchenko.

Thèses en préparation à Paris Saclay en cotutelle avec Scientific research institute of biology and biotechnology problems , dans le cadre de École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé (Villejuif, Val-de-Marne ; 2015-....) , en partenariat avec Stabilité Génétique et Oncogenèse (laboratoire) , Recombinaison / Réparation et cancer (equipe de recherche) et de Université Paris-Sud (1970-2019) (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-12-2018 .


  • Résumé

    L'ADN cellulaire est constamment endommagé par des facteurs exogènes et endogènes, ce qui entraîne des altérations des bases et des sucres, ainsi que des ruptures de brins d'ADN. Les ruptures d'ADN à un ou deux brins (SSB et DSB, respectivement) peuvent être générées directement par les radicaux libres d'oxygène ou comme intermédiaires de la réparation par excision de l'ADN (1). L'absence de détection et de réparation des ruptures de brin d'ADN peut avoir des conséquences délétères pour la cellule, comme les aberrations chromosomiques, l'instabilité génomique et la mort cellulaire. La famille de protéines poly-(ADP-ribose) polymérase (PARP) catalyse la synthèse de polymères ADP-ribose (PAR) liés de manière covalente à des protéines accepteurs en utilisant le nicotinamide adénine dinucléotide (NAD+) comme substrat (2). Les protéines PARP sont considérées comme des détecteurs de dommages à l'ADN qui, après s'être liées aux ruptures de brins, commencent la synthèse d'une chaîne de poly(ADP-ribose) attachée sur eux même ou les protéines accepteurs nucléaires. L'auto-ADP-ribosylation catalysée par les PARPs et la modification de protéines nucléaires sont fortement activées après exposition de cellules à des agents endommageant l'ADN (3). Il a été postulé qu'à des niveaux moins importants de dommages à l'ADN cellulaire, les PARP régulent les voies de réparation de l'ADN en recrutant des protéines pour répare les coupures de brins et, dans des cas de dommages de l'ADN sévères, favorisent la mort cellulaire par nécrose, apoptose ou les deux (4). La présence répandue de protéines PARP chez les eucaryotes et leur activité de modification post-traductionnelle inhabituelle pourraient s'expliquer par le fait que, dans les cellules eucaryotes, l'ADN est étroitement conditionné dans un complexe appelé chromatine, structure extrêmement complexe à plusieurs niveaux d'organisation. Ainsi, l'ADP-ribosylation de protéines nucléaires catalysée par PARP est nécessaire pour la régulation de la réparation et de la transcription de l'ADN dans le contexte de la chromatine dans les noyaux de cellules eucaryotes (5). Le laboratoire de Villejuif a récemment découvert le phénomène jusqu'alors inconnu de la modification réversible post-réplicative de l'ADN via les mono- et poly-(ADP-ribosyl)ations (MARylation et PARylation, respectivement) de terminaisons de rupture de brin d'ADN catalysées par le poly (ADP-ribose) de mammifère. polymérases PARP1-3 (6). Cette découverte fournit de nouvelles informations moléculaires sur la fonction des PARP. Les activités des enzymes PARP1-3 ont été partiellement caractérisées in vitro et certaines preuves indirectes de la présence d'adduits PAR-ADN dans des cellules humaines après l'exposition aux traitements génotoxiques ont été obtenues (7). Le génome d'Arabidopsis thaliana, organisme végétal modèle largement utilisé, code pour au moins trois PARP présumés: atPARP1 (At4g02390), atPARP2 (At2g31320) et atPARP3 (At5g22470) (8-9). Il est important de noter que les PARP de plantes sont structurellement homologues aux protéines PARP de mammifère. Le degré élevé de conservation au niveau des acides aminés entre Arabidopsis et les formes mammifères de ces enzymes suggère que la fonction de PARP est conservée entre les plantes et les animaux. Contrairement aux systèmes mammifères, on sait étonnamment très peu de choses sur la PARylation catalysée par les PARP chez les plantes. À l'heure actuelle, aucune protéine PARylée, à l'exception des histones et des PARP, n'a été identifiée chez les plantes. dans le développement des plantes et dans les réponses au stress. Compte tenu du degré élevé de conservation au niveau de la séquence protéique entre Arabidopsis et les homologues d'enzymes PARP chez les mammifères, nous proposons que la protéine AtPARP3 d'Arabidopsis puisse directement ADP-ribosyler les extrémités des cassures de brins d'ADN. De plus, la disponibilité de mutants génétiques A. thaliana déficients en AtPARP1, AtPARP2 et AtPARP3 nous offre la possibilité d'étudier le rôle in vivo de l'ADP-ribosylation de l'ADN génomique dépendant de AtPARP3. Nous proposons ici pour la première fois d'étudier l'ADP-ribosylation covalente de substrats d'ADN par la protéine AtPARP3 d'Arabidopsis thaliana. L'objectif du projet est d'isoler l'ADNc du gène de la poly-ADP-ribose polymérase 3 (AtPARP3) d'Arabidopsis thaliana et de caractériser la spécificité de substrat de la protéine AtPARP3 recombinante vis-à-vis des substrats d'ADN in vitro et in vivo. Le projet comprend trois parties: (i) la construction chimique et la caractérisation de substrats d'ADN pour les poly-ADP-ribose polymérases d'origine humaine et Arabidopsis; (ii) caractérisation biochimique de la protéine AtPARP3 purifiées sur des substrats d'ADN; (iii) rechercher la présence d'adduits ADN-ribosylés dans l'ADN génomique d'Arabidopsis thaliana traité par divers agents endommageant l'ADN. Nous espérons que la réussite du projet actuel permettra de mieux comprendre les mécanismes moléculaires de la réponse aux dommages de l'ADN et de la réparation de l'ADN dans les cellules humaines et végétales. En particulier, les caractérisations biochimique et par spectrométrie de masse, ainsi que l'utilisation de mutants végétaux dans ce projet, nous permettront: (a) d'établir la présence d'adduits d'ADN ribosylés dans des cellules végétales et leur corrélation avec un traitement génotoxique; (b) d'identifier les dommages à l'ADN susceptibles à une ADP-ribosylation par AtPARP3; (c) caractériser le rôle d'AtPARP3 dans le traitement et la réparation des brins d'ADN. Enfin, les résultats du présent projet aideraient à comprendre le rôle biologique de la modification de l'ADN covalent catalysée par les protéines PARP chez les plantes et pourraient également contribuer à améliorer l'efficacité du traitement anticancéreux. Bibliographie. 1. Pommier, Y., Leo, E., Zhang, H., and Marchand, C. (2010) Chem Biol 17, 421-433 2. Hottiger, M. O., Hassa, P. O., et al., and Koch-Nolte, F. (2010) Trends Biochem. Sci. 35, 208-219 3. de Murcia, G., and Menissier de Murcia, J. (1994) Trends Biochem Sci 19, 172-176 4. Caldecott, K. W. (2014) DNA Repair (Amst) 19, 108-113 5. Kraus, W. L., and Hottiger, M. O. (2013) Mol. Aspects Med. 34, 1109-1123 6. Talhaoui, I., et al., Saparbaev, M. K., and Ishchenko, A. A. (2016) Nucleic acids research 44, 9279-9295 7. Zarkovic, G., et al., and Ishchenko, A. A. (2018) Nucleic acids research 46, 2417–2431 8. Babiychuk, E., Cottrill, P. B., et al., Inze, D., and Kushnir, S. (1998) Plant J 15, 635-645 9. Hunt, L., Lerner, F., and Ziegler, M. (2004) New Phytologist 163, 31-44

  • Titre traduit

    Study of the roles of Arabidopsis Poly(ADP-ribose) polymerases in covalent modification of DNA strand breaks termini in vitro and in vivo.


  • Résumé

    Cellular DNA is constantly damaged by exogenous and endogenous factors resulting in base and sugar alterations and DNA strand breaks. Single- and double-strand DNA breaks (SSBs and DSBs, respectively) can be generated either directly by oxygen free radicals or as intermediates of DNA excision repair (1). Failure to detect and repair DNA strand breaks can have deleterious consequences for the cell, e.g. chromosomal aberrations, genomic instability and cell death. The poly(ADP-ribose) polymerase (PARP) family of proteins catalyse the synthesis of polymers of ADP-ribose (PAR) covalently attached to acceptor proteins using nicotinamide adenine dinucleotide (NAD+) as a substrate (2). PARP proteins are considered DNA damage sensors that after binding to strand breaks, poly(ADP-ribosyl)ate themselves and nuclear acceptor proteins. PARP1-catalysed self-poly-ADP-ribosylation (PARylation) and modification of nuclear proteins is greatly activated after exposure of cells to DNA-damaging agents (3). It was postulated that at lower levels of cellular DNA damage, PARPs regulate the DNA repair pathways by recruiting proteins to strand breaks, and at more severe DNA damage, promote cell death via necrosis, apoptosis, or both (4). The widespread presence of PARP proteins in eukaryotes and their unusual post-translational modification activity could be explained by the fact that in eukaryotic cells, DNA is tightly packed into a complex referred to as chromatin, a highly complicated structure with several levels of organization. Thus, the PARP-catalysed PARylation of nuclear proteins is required for regulation of DNA repair and transcription in the context of chromatin in eukaryotic cell nuclei (5). Recently, Villejuif laboratory uncovered the previously unknown phenomenon of post-replicative reversible modification of DNA via mono- and poly(ADP-ribosyl)ation (MARylation and PARylation, respectively) of DNA strand break termini catalyzed by the mammalian poly(ADP-ribose) polymerases PARP1-3 (6). This discovery provides novel molecular insights into the PARPs function. The activities of PARP1-3 enzymes have been partially characterized in vitro and some indirect evidences of the presence of PAR–DNA adducts in human cells after a genotoxic treatment have been obtained (7). The genome of Arabidopsis thaliana, a widely used model plant organism, encodes at least three putative PARPs: atPARP1(At4g02390), atPARP2(At2g31320) and atPARP3 (At5g22470) (8-9). Importantly, the plant PARPs are structurally homologous to mammalian PARP proteins. The high degree of conservation at the amino acid level between Arabidopsis and mammalian forms of these enzymes suggests that PARP function is conserved between plants and animals. In contrast to mammalian systems, surprisingly very little is known about PARPs-catalyzed PARylation in plants. At present, no PARylated proteins except histones and PARPs have been identified in plants. Identification of new poly(ADP-ribose) acceptor molecules including proteins and nucleic acids will help in understanding the regulatory function of PARPs-catalyzed PARylation in plant development and in stress responses. Considering the high degree of conservation at the protein sequence level between Arabidopsis and mammalian homologues of PARP enzymes, we propose that Arabidopsis AtPARP3 protein might directly ADP-ribosylate the termini of DNA strand breaks. Furthermore, availability of genetic mutants of A. thaliana deficient in AtPARP1, AtPARP2 and AtPARP3 offers to us possibility to investigate the in vivo role of AtPARP3 dependent ADP-ribosylation of genomic DNA. Here we propose for the first time to study the covalent ADP-ribosylation of DNA substrates by Arabidopsis thaliana AtPARP3 protein. The aim of the project is to isolate the cDNA of the gene of Arabidopsis thaliana Poly-ADP-ribose polymerase 3 (AtPARP3) and to characterize the substrate specificity of the recombinant PARP3 protein towards DNA substrates in vitro and in vivo. The project consists of three parts (i) chemical construction and characterization of DNA substrates for the poly-ADP-ribose polymerases from human and Arabidopsis; (ii) biochemical characterization of the purified AtPARP3 against DNA substrates; (iii) search for the presence of ADP-ribosylated DNA adducts in the genomic DNA of Arabidopsis thaliana treated by various DNA damaging agents. We expect that successful completion of the present project would lead to a better understanding of the molecular mechanisms of DNA damage response and DNA repair in human and plant cells. Particularly, the biochemical and mass spectrometry characterization together with the use of plant mutants in this project will allow us to: (a) establish the presence of ADP-ribosylated DNA adducts in plant cells and their correlation with a genotoxic treatment; (b) identify DNA damage prone to ADP-ribosylation by AtPARP3; (c) characterize the role of AtPARP3 in the DNA strand breaks processing and repair. Finally, the results of present project would help to understand biological role of the covalent DNA modification catalyzed by PARP proteins in plants and may also help to enhance the efficiency of anti-cancer therapy. Bibliography. 1. Pommier, Y., Leo, E., Zhang, H., and Marchand, C. (2010) Chem Biol 17, 421-433 2. Hottiger, M. O., Hassa, P. O., et al., and Koch-Nolte, F. (2010) Trends Biochem. Sci. 35, 208-219 3. de Murcia, G., and Menissier de Murcia, J. (1994) Trends Biochem Sci 19, 172-176 4. Caldecott, K. W. (2014) DNA Repair (Amst) 19, 108-113 5. Kraus, W. L., and Hottiger, M. O. (2013) Mol. Aspects Med. 34, 1109-1123 6. Talhaoui, I., et al., Saparbaev, M. K., and Ishchenko, A. A. (2016) Nucleic acids research 44, 9279-9295 7. Zarkovic, G., et al., and Ishchenko, A. A. (2018) Nucleic acids research 46, 2417–2431 8. Babiychuk, E., Cottrill, P. B., et al., Inze, D., and Kushnir, S. (1998) Plant J 15, 635-645 9. Hunt, L., Lerner, F., and Ziegler, M. (2004) New Phytologist 163, 31-44.