Développement de nanobodies ciblant la Protéine S anticoagulante dans le traitement des hémarthroses et de l'arthropathie hémophiliques

par Josepha-clara Sedzro

Projet de thèse en Sciences pharmacologiques

Sous la direction de Delphine Borgel et de François Saller.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....) , en partenariat avec Inserm U 1176 - Hémostase, Inflammation, Thrombose (laboratoire) et de Université Paris-Sud (1970-2019) (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2018 .


  • Résumé

    La protéine S (ProS) est une protéine vitamine K-dépendante qui limite la génération de thrombine à plusieurs niveaux de la cascade de la coagulation. Au niveau moléculaire, cette protéine anticoagulante stimule les activités de la protéine C activée (PCa) et de l'inhibiteur de la voie du facteur tissulaire (TFPI), et inhibe directement le facteur IX activé (FIXa) au sein du complexe ténase intrinsèque. En utilisant des approches génétiques et pharmacologiques, nous avons très récemment montré dans une étude princeps que le ciblage de la ProS constituait une approche originale dans le traitement de l'hémophilie (Prince et al. Blood 2018). Au cours de cette étude, l'absence de ProS chez des souris hémophiles (souris F8-/-Pros1-/- et F9-/-Pros1-/-) ainsi que l'inhibition de la ProS par un anticorps polyclonal chez des souris hémophiles, ne corrigent que modérément le temps de saignement. En revanche, ces ciblages de la ProS permettent tous deux de diminuer très fortement les saignements intra-articulaires dans un modèle d'hémarthroses aigües (Prince et al. Blood 2018). Ceci peut être attribué à l'inhibition de l'activité anticoagulante de la ProS au niveau intra-articulaire. En effet, la ProS (ainsi que le TFPI) est fortement exprimée par les synoviocytes dans les articulations de souris (et de patients) hémophiles, ce qui participerait à créer un environnement fortement anticoagulant et favorable au développement des hémarthroses. Les hémarthroses et leur conséquence pathologique dévastatrice, l'arthropathie hémophilique, sont des complications majeures chez les patients hémophiles. L'absence de traitement spécifique à l'heure actuelle souligne le fort besoin de stratégies thérapeutiques innovantes dans ce domaine. Suite à ces travaux, nous avons choisi de développer des anticorps à domaine unique (nanobodies) produits chez le lama et ciblant la ProS, qui trouveraient ainsi des applications dans le traitement des hémarthroses et de l'arthropathie chez les patients hémophiles. Les nanobodies sont des anticorps de petite taille (15 kDa sous forme monovalente) particulièrement adaptés pour des applications thérapeutiques et qui peuvent être générés par des approches de criblage à haut débit (phage display). Grâce à l'expertise de notre laboratoire dans le domaine des nanobodies dirigés contre des protéines de l'hémostase (Dr Peter Lenting et Dr Cécile Denis), nous avons apporté une preuve de faisabilité en identifiant plusieurs nanobodies reconnaissant la ProS humaine, à la suite d'un premier criblage de 400 nanobodies, à partir d'une banque immune. Parmi ceux-ci, le nanobody PS003 est très spécifique de la ProS et très affin (Kd = 10 nM), pour un nanobody monovalent. La caractérisation du nanobody PS003 est en cours, et les premiers résultats montrent que, de façon surprenante, ce nanobody potentialise l'activité cofacteur de la PCa de la ProS. En décuplant nos forces de criblage (>5000 nanobodies criblés), nous pourrons identifier un nombre plus important de nanobodies anti-ProS. A titre d'exemple, un deuxième criblage nous a récemment permis d'identifier un autre nanobody (PS004) présentant une forte affinité pour la ProS, et sa production/purification à plus grande échelle est actuellement en cours pour le caractériser ensuite plus en détail. Nous avons également engagé une collaboration avec la Plateforme d'Ingénierie des Anticorps de l'Institut Pasteur de Paris (Dr Gabriel Aymé) afin d'immuniser un lama puis de préparer une nouvelle banque immune présentant une diversité de nanobodies beaucoup plus importante. De nouvelles conditions de sélection lors du phage-display seront testées, et nous pourrons aussi bénéficier dans le futur de techniques d'automatisation à très haut-débit actuellement mises en place sur cette plateforme. Le but est ainsi de de générer rapidement le plus grand nombre possible de nanobodies anti-ProS reconnaissant des épitopes très variés sur l'ensemble de la protéine. L'ensemble des nanobodies identifiés seront évalués dans des tests plasmatiques ciblant les activités anticoagulantes de la ProS (activités cofacteurs de la PCa et du TFPI, inhibition directe du FIXa et du complexe ténase intrinsèque) humaine et murine. Comme ces différentes activités anticoagulantes de la ProS impliquent des régions différentes de la ProS, nous espérons pouvoir identifier des nanobodies monovalents (nanobodies NbPCa, nanobodies NbTFPI, nanobodies NbFIXa) qui inhibent spécifiquement chacune de ses activités. Dans l'état actuel de nos connaissances, nous ignorons encore quelle activité anticoagulante de la ProS intervient dans ses effets pro-hémorragiques favorisant le développement des hémarthroses hémophiliques, et ceci pourrait être évalué au cours de ce projet de thèse. La ProS présente également des activités cellulaires en activant le récepteur MerTK, un récepteur à activité tyrosine kinase impliqué dans l'élimination par les macrophages des cellules apoptotiques ou des débris cellulaires (efférocytose). Très récemment, il a été montré que MerTK était impliqué dans l'élimination de globules rouge eryptotiques et la clairance des hématomes cérébraux, favorisant ainsi la phase de récupération à la suite d'hémorragies intracérébrales (Chang et al. 2017). Par analogie, il est donc possible d'émettre l'hypothèse que le couple ProS/MerTK pourrait être impliqué dans la clairance des saignements intra-articulaires lors des hémarthroses, limitant les conséquences à long terme d'un nombre répété de tels saignements (arthropathie hémophilique). Notre approche de ciblage de la ProS par des nanobodies devra par conséquent prendre en compte le potentiel bénéfice de la ProS pour contrer le développement de l'arthropathie hémophilique. Ainsi, nous génèrerons des nanobodies qui, non seulement inhibent l'activité anticoagulante de la ProS, mais préservent également sa capacité d'activation du récepteur MerTK. Dans ce but, des tests cellulaires et/ou en systèmes purifiés sont actuellement développés pour caractériser les effets des nanobodies candidats sur la liaison de la ProS à MerTK et sur l'activation (phosphorylation sur tyrosine) de ce récepteur par la ProS. De plus, des tests plus fonctionnels d'érythrophagocytose par des macrophages sont mis au point afin de vérifier que les nanobodies candidats n'inhibent pas l'efférocytose MerTK-dépendante de globules rouges éryptotiques. Le développement d'une telle approche thérapeutique ciblant spécifiquement les activités anticoagulantes tout en épargnant les activités cellulaires de la ProS pourrait constituer un avantage majeur comparativement à une approche antisens visant à diminuer de façon globale l'expression de la ProS. En raison de leurs petites tailles et de leur clairance rénale rapide, les nanobodies monovalents répondant à nos critères (inhibition de l'activité anticoagulante de la ProS, préservation de l'activation de MerTK, reconnaissance de la ProS murine) devront être ensuite bivalentisés pour une future application thérapeutique. Egalement, ces nanobodies bivalents seront couplés à de l'albumine ou à un peptide de liaison à l'albumine (peptide ABP) pour augmenter leur demi-vie plasmatique. De plus, le couplage à l'albumine ou au peptide ABP permettra de vectoriser les nanobodies anti-ProS candidats au niveau des articulations enflammées, comme observé avec un nanobody anti-TNF bivalent et couplé à un nanobody anti-albumine actuellement en cours d'essai clinique dans la polyarthrite rhumatoïde. Au cours de ce travail, une série de nanobodies bivalents (par exemple, NbPCa-NbPCa-ABP ou NbTFPI-NbTFPI-ABP) ou bispécifiques (par exemple, NbPCa-NbTFPI-ABP) seront ainsi développés puis testés dans des modèles murins d'hémarthroses aigues et d'arthropathie hémophilique, en collaboration avec l'équipe du Dr Laurent Frenzel (Institut Imagine, Paris), afin de vérifier leurs potentiels thérapeutiques.

  • Titre traduit

    Development of nanobodies targeting anticoagulant Protein S in the treatment of hemarthroses and arthropathy in hemophilic patients


  • Résumé

    Protein S (ProS) is a vitamin K-dependent protein that limits the generation of thrombin at different levels of the coagulation cascade. ProS thus stimulates the anticoagulant activities of activated protein C (APC) and tissue-factor pathway inhibitor (TFPI) and directly inhibits activated factor IX (FIXa) and the intrinsic tenase complex. Recently, we used genetic and pharmacological approaches to demonstrate for the first time that targeting anticoagulant ProS could be therapeutically attractive in hemophila (Prince et al. Blood 2018). In this study, bleeding times were only modestly corrected in hemophilic mice in which the expression of ProS was suppressed (F8-/-Pros1-/- and F9-/-Pros1-/- mice) or in which ProS was inhibited by a polyclonal antibody. However, intra-articular bleedings were abolished in a model of acute hemarthroses (Prince et al. Blood 2018). This has been attributed to an inhibition of the anticoagulant activity of ProS in the joint. Indeed, ProS (together with TFPI) is highly expressed by synoviocytes in hemophilic joints, and would greatly participate in creating a strong anticoagulant environment favoring the development of hemarthroses. Hemarthroses and hemophilic arthropathy are major complications in hemophilic patients that still lack specific treatments to date, and innovative therapeutic strategies are thereby crucially required. In this context, we chose to develop llama-derived single-domain antibodies (nanobodies) directed against ProS, that could be used in the treatment of hemarthroses and arthropathy in hemophilic patients. Nanobodies are small-sized non-conventional antibodies (15 kDa for monovalent nanobodies) that appear particularly suitable for therapeutic applications and that can be generated through high-throughput screening approaches (phage display). To achieve this purpose, we can benefit from the expertise of our laboratory in the field of nanobodies directed against hemostatic proteins (Dr Peter Lenting and Dr Cécile Denis). A first proof-of-concept screening of 400 nanobodies from an immune library allowed us to identify a number of nanobodies effectively recognizing human ProS. One of these nanobodies (PS003) has been produced and purified, and is very specific for ProS while exhibiting a high affinity for ProS (Kd = 10 nM). The characterization of the nanobody PS003 is in progress and preliminary results indicated that PS003 unexpectedly potentiate the APC-cofactor activity of ProS. We are currently screening a higher number of nanobodies (>5000) and a second round of screening allowed us to identify another monovalent nanobody (PS004) recognizing human ProS with a high affinity. Its large-scale production/purification is in progress for further characterization. In addition, a collaboration was engaged with the Antibody Engineering Core Facility of Pasteur Institute (Dr Gabriel Aymé, Paris) for preparing a novel immune library of nanobodies with a greater diversity. Also, we will use different strategies for the selection of nanobodies by phage-display and, in the future, we will benefit from very high-throughput screening techniques provided by this core facility. The eventual goal is to identify the highest number of anti-ProS nanobodies for further characterization. All the identified nanobodies will be explored in plasma assays to test their abilities to inhibit each anticoagulant activity (i.e. APC- and TFPI-cofactor activities, FIXa inhibition) of both human and mouse ProS. As distinct regions of ProS are involved in these 3 anticoagulant activities, it is theoretically possible to identify monovalent nanobodies that specifically abolish the APC- (NbAPC nanobodies) and the TFPI- (NbTFPI nanobodies) cofactor activity of ProS, or the ability of ProS to directly inhibit FIXa and the intrinsic tenase complex (NbFIXa nanobodies). The relative importance of such anticoagulant activities in the pathologic role of ProS in hemarthroses is currently unknown, which might be addressed in the present project. Interestingly, ProS exhibits non-anticoagulant cellular activities through activation of MerTK, a receptor tyrosine kinase involved in the removal of apoptotic cells and cell debris by macrophages and non-professional phagocytes (i.e. efferocytosis). Very recently, MerTK has been found to be implicated in the efferocytosis of eryptotic erythrocytes and recovery after intracerebral hemorrhages (Chang et al. J Clin Invest 2017). Thus, we hypothesized that ProS/MerTK could similarly help clear intra-articular bleedings during hemarthroses, thus limiting the long-term pathological consequences of repeated episodes of such bleedings within the joints (i.e. hemophilic arthropathy). Consequently, we chose to take into account this dual role of ProS which could favor intra-articular bleedings (deleterious role) while limiting the development of inflammation and tissue damage leading to hemophilic arthropathy (protective role). Accordingly, we aim at identifying anti-ProS nanobodies that not only inhibit the anticoagulant activities of ProS but also preserve its capacity to activate MerTK. To this goal, the candidate anti-ProS nanobodies will be tested in cell-based assays and in purified systems to evaluate their effects on the ability of ProS to bind to and activate MerTK and to stimulate the efferocytosis of eryptotic erythrocytes by macrophages. The development of such assays is in progress in our laboratory. Inhibiting the anticoagulant activities of ProS while sparing the ability of ProS to activate MerTK would be safer and advantageous as compared to an antisense approach seeking to globally down-regulate the expression of ProS. Due to their small sizes and rapid renal clearance, bivalent forms of our candidate monovalent nanobodies will be generated for therapeutic purposes. In addition, these bivalent nanobodies will be linked to albumin or albumin-binding peptides (ABP) to increase plasma half-life and improve targeting into inflamed joints. This strategy has a precedent, as a bivalent anti-TNF nanobody coupled to an anti-albumin nanobody has been developed to treat rheumatoid arthritis and is currently tested in clinical trials. Overall, our goal is to generate a series of bivalent (e.g. NbAPC-NbAPC-ABP or NbTFPI-NbTFPI-ABP) or bispecific (e.g. NbAPC-NbTFPI-ABP) anti-ProS nanobodies that will be eventually tested in mouse models of acute hemarthroses and hemophilic arthropathy (in collaboration with Dr Laurent Frenzel, Imagine Institute, Paris) to evidence their therapeutic potential.