Effets secondaires cardiaques induits par les traitements anticancereux : rôle de la protéine EPAC1 dans la cardioprotection et le traitement du cancer

par Anissa Belhadef

Projet de thèse en Physiologie, physiopathologie

Sous la direction de Eric Morel et de Christophe Lemaire.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....) , en partenariat avec Signalisation et Physiopathologie Cardiovasculaire (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 30-09-2018 .


  • Résumé

    Nouveaux mécanismes et voies de signalisation impliqués en cardio-oncologie : rôle cardioprotecteur de EPAC1 dans la toxicité induite par les Anthracyclines 1/ Contexte Actuellement, le traitement du cancer connait de grandes améliorations sur le plan du diagnostic et de l'efficacité de traitements novateurs conduisant à une augmentation significative de la survie/qualité de vie des patients traités. Cependant, l'incidence de cette pathologie ne cesse d'augmenter (400 000 nouveaux cas de cancer pour l'année 2017 en France). La compréhension des mécanismes cellulaires et moléculaires associés à la croissance tumorale a permis l'émergence de nombreuses stratégies thérapeutiques efficaces, en plus de l'arsenal thérapeutique conventionnel, telles que la radiothérapie ou la chimiothérapie. Cette dernière est un traitement systémique du cancer permettant l'élimination des cellules cancéreuses dans l'ensemble de l'organisme. Initialement, elle a été utilisée dans les tumeurs solides métastatiques et dans les néoplasies hématologiques (leucémies et lymphomes). Elle est aujourd'hui de plus en plus prescrite seule ou en combinaison avec d'autres thérapies dans de nombreux cancers. Si la chimiothérapie inhibe la croissance tumorale, elle peut le faire de différentes façons. Il existe une multitude de drogues utilisées en chimiothérapie, classées en deux grandes catégories : les cytotoxiques (blocage synthèse, fonctionnement et multiplication cellulaire) et non cytostatiques (blocage de fonctions anormales des cellules cancéreuses et/ou du microenvironnement)1. Parmi les médicaments cytotoxiques, les Anthracyclines constituent l'une des classes les plus importantes. Ce sont des antibiotiques, isolés à partir de Steptomyces peucetius en 19632, qui s'intercalent dans l'ADN. Elles peuvent également générer un fort stress oxydatif et inhiber la Topoisomérase II alpha3 conduisant à la mort des cellules tumorales. La Doxorubicine (Dox), est une des molécules chef de file de la famille des Anthracyclines, toujours très largement utilisée en chimiothérapie antitumorale pour traiter de nombreux types de cancers (cancer du sein, leucémie, lymphome, sarcome). Cependant, son utilisation peut conduire à l'apparition d'une cardiotoxicité conduisant à une diminution de la qualité de vie du patient et/ou à une morbi/mortalité ce qui, à terme, limite le bénéfice global pour le patient pour ce type de thérapie anticancéreuse. La fréquence d'apparition est fonction de la dose mais peut être estimée à 20 % en moyenne et dépasser plus de 50 % pour les patients âgés. En effet, une étude clinique prospective multicentrique réalisée sur 500 patients de 65 ans et plus (plus susceptibles de développer un cancer) a montré que 53 % de ces patients ont développé une cardiotoxicité sévère dans les 6 mois après l'arrêt du traitement anticancéreux4. Sur le plan clinique, la cardiotoxicité des Anthracyclines se traduit par des altérations cardiaques (arythmies) ainsi que la mise en place d'insuffisance cardiaque et de cardiomyopathie dilatée qui peuvent se développer des semaines, voire des années post-exposition. Par ailleurs, cette toxicité cardiaque est également observée chez les patients traités à l'aide de thérapies ciblées ou dans le cadre des nouvelles thérapies de modulation de l'immunité de type immunocheckpoint5. Dans le cadre de la chimiothérapie, plusieurs générations d'Anthracyclines ont été produites dans le but de réduire cette toxicité cardiaque. Bien que ces nouvelles molécules, utilisées à plus hautes doses, permettent une marge thérapeutique anticancéreuse supérieure, elles génèrent la même cardiotoxicité et donc les mêmes limitations d'efficacité de traitement. Cette limite pourrait être franchie par l'emploi de molécules cardioprotectrices utilisées en combinaison, permettant l'emploi d'une chimiothérapie plus efficace afin d'augmenter encore le gain thérapeutique global. Aujourd'hui, la cardio-prévention clinique contre les effets des Anthracyclines est quasi inexistante avec un seul cardioprotecteur ayant obtenu une AMM, le Dexrazoxane, dont l'utilisation est restreinte et controversée6. En effet, le Dexrazoxane ne peut être employé que pour des doses d'Anthracyclines élevées pour lesquelles la toxicité cardiaque pourrait être déjà présente ou subclinique. De plus, le Dexrazoxane limiterait l'efficacité des thérapies anticancéreuses ou encore pourrait générer des tumeurs secondaires. Les mécanismes réels sous-jacents des cardiotoxicités de ces traitements anticancéreux tout confondus ou ceux de leur cardioprévention sont donc très peu élucidés. 2/ Objectifs généraux de la thèse L'objectif de nos travaux est donc : 1/ de mieux comprendre les mécanismes liés à la cardiotoxicité des chimiothérapies anticancéreuses en particulier celle des Anthracyclines 2/ d'identifier de nouvelles voies de signalisation/molécules afin de développer des traitements permettant de réduire les pathologies cardiaques induites par les Anthracyclines tout en conservant les effets cytotoxiques sur les cellules tumorales, voire de les potentialiser. Afin de réduire le champ d'investigation en accord avec le cadre d'une thèse, nous nous sommes focalisés sur l'étude du facteur d'échange Epac. 3/ de mettre en place des modèles « bancs d'essai » caractérisés de cardio-oncologie impliquant une pathologie cancéreuse de façon à tester les cibles moléculaires identifiées et de l'étendre aux nouvelles molécules/stratégies combinatoires développées actuellement en clinique impliquant les chimiothérapies anticancéreuses. Cette étude transversale mêle donc deux domaines distincts (cardiologie et oncologie) mais de plus en plus associés ; tous deux axes principaux du LabEx LERMIT depuis 2011. De plus, une étude clinique de 2015 a montré que 51 % des patients cancéreux sont décédés de leur cancer mais aussi que 33 % ont succombé à des pathologies cardiaques. La cardiotoxicité générée par les traitements anticancéreux représente donc un problème majeur de santé publique. En effet, l'incidence du cancer tend à augmenter au vu de l'allongement de l'espérance de vie mondiale, de l'efficacité et de la mise en place de nouveaux traitements et de la chronicisation, à défaut de guérison, de la pathologie cancéreuse avec des traitements au long cours. Cette prise de conscience est également illustrée par la création récente de structures fédératives (Société Internationale de Cardio-oncologie, Cercle de Cardio-Oncologie de la SFC, Meeting national Cancer et Cœur 3/ Stratégies actuelles Au niveau cellulaire, la Dox génère un stress oxydant, s'intercale dans l'ADN, inhibe la Topoisomérase II et génère une détresse énergétique ; l'ensemble conduisant selon le dogme, à la mort des cardiomyocytes. Néanmoins, des données récentes montrent l'implication de voies de signalisation de manière nécessaire et suffisante à l'apparition de ces cardiomyopathies chimio-induites7. La recherche de nouvelles stratégies thérapeutiques permettant de réduire les effets cardiotoxiques de la Dox sans altérer son activité antitumorale a ainsi émergé ces dernières années. De plus, un de nos proches collaborateurs, le Dr A Ghigo de l'unité du Pr E Hirsch a montré très récemment que l'inhibition du seul acteur moléculaire PI3Kγ pouvait conduire à un avantage thérapeutique anticancéreux double avec simultanément une cardioprotection contre la cardiotoxicité induite par les Anthracyclines et une réduction de la croissance tumorale10 suggérant l'émergence, au stade Recherche, d'une révolution dans la stratégie thérapeutique anticancéreuse avec l'identification de molécules à doubles actions protectrices cardiaques et effectrices antitumorales. Les études portant sur les petites protéines G Rac1 et RhoA en sont également de bons exemples. En effet, ces études ont montré que l'inhibition de ces deux cibles indépendantes permettait la prévention de la cardiotoxicité induite par la Dox et la diminution de la résistance à la Dox de certains types de cellules cancéreuses8,9. Or, l'un des activateurs indirects communs de ces petites protéines G impliquées dans la cardiotoxicité des Anthracyclines est la protéine EPAC. Notre équipe a été la première à démontrer le rôle d'EPAC, un facteur d'échange directement activé par l'AMPc pour les petites protéines G (Rap, Rac, Ras) dans le remodelage cardiaque11. Au niveau tumoral, EPAC est connu pour jouer un rôle important dans le cancer. En effet, il est également impliqué, via les petites protéines G, dans la migration et l'adhésion cellulaire et donc dans l'invasion tissulaire et la formation de métastases12. Une autre étude a montré in vitro et in vivo, qu'EPAC1 induisait la migration de cellules de mélanome de façon calcium-dépendante et que son invalidation limitait cette migration ainsi que la formation de métastases13,14,15. De plus, l'inhibition d'EPAC (Esi09) a démontré in vivo une protection contre le développement métastatique dans le cancer pancréatique16. Enfin, l'inhibition d'EPAC est également reconnue comme étant bénéfique dans un modèle de leucémie17 et de cancer du sein métastatique18, deux des principales indications thérapeutiques de la Doxorubicine. 4 Etat d'avancement Ce projet a fait partie de la création du LERMIT en 2011 sous le label « CARDIOTOX 1.3 » et soutenu financièrement par un budget de fonctionnement et par le financement de la thèse de Mme Marianne Mazevet sur 4 ans. Les principales conclusions et contributions sont résumées ci-dessous : • Caractérisation sur du long terme d'un modèle in vivo de cardiomyopathie dilatée induit par la Doxorubicine • Caractérisation sur du long terme d'un modèle in vivo d'hypertrophie cardiaque en radiothérapie • Calibration d'un modèle in vitro de culture primaire de cardiomyocytes de rat nouveau-nés traités à la Doxorubicine • Démonstration de l'implication de l'isoforme EPAC1 et non EPAC2 dans l'hypertrophie radio-induite19,20 • Rôle de Rho/CTGF dans la fibrose radio-induite • Implication d'EPAC1 dans les dommages à l'ADN induit par les Anthracyclines dans les cardiomyocytes • Caractérisation de la réponse calcique à un traitement à la Doxorubicine sur du long terme (15 semaines) • Caractérisation des variations biochimiques des acteurs moléculaires de l'homéostasie calcique au cours de ce traitement (Dox, 15 semaines de suivi) • Altération sélective en thérapies combinées de l'activité transcriptionnelle de marqueurs de remodelage cardiaque • Ce travail s'est accompagné de la mise en place d'une activité d'enseignement (ED4E5) et de communication dans le cadre du TORINO, DU Thoracique piloté par les Pr E Deutsch et B Besse et M2 Biocoeur piloté par le Pr B Ghaleh avec une diffusion dans les centres hospitaliers de l'IGR, Bichat, Saint Antoine. • 3 publications et 2 en préparation, 1thèse, 1 HDR Cette première série de mise en place nous a permis de caractériser un modèle de cardio oncologie relevant non présent dans le laboratoire précédemment. De plus, ces conclusions ont permis de montrer un rôle central d'EPAC1 dans la cardiotoxicité des Anthracyclines. Ces résultats et la cible thérapeutique EPAC1 ont été transférés dans la partie cible thérapeutique T1.1 du LabEx LERMIT avec l'objectif d'identifier/améliorer l'inhibition pharmacologique de EPAC1 dans les champs de l'hypertrophie/insuffisance cardiaque classique et de la cardio-oncologie. Ce dernier point s'inscrit donc dans l'axe d'innovation thérapeutique du LabEx LERMIT. Cette première étape a permis la continuité d'une seconde développée et maturée en interne au sein du laboratoire U1180 en partenariat entre le Dr C. Lemaire et le Dr E. Morel avec la thèse de M. Maxance Ribeiro dont l'aboutissement de la thèse sera fin 2018 avec l'objectif de comprendre les mécanismes sous-jacents de la cardiotoxicité induite par les Anthracyclines (Doxorubicine) et de comprendre le rôle d'EPAC dans celle-ci en l'absence de pathologie cancéreuse. Pour ce faire les modèles suivants ont été utilisés : modèles in vivo de souris WT/EPAC1 KO (injections iv Dox 12 mg/kg) et in vitro de cultures primaires de cardiomyocytes de rats nouveau-nés (NRVM, Dox 1 µM). Au cours de la thèse de M. M. Ribeiro ont été caractérisés les points suivants : • Caractérisation des effets induits par la Dox in vitro avec une induction des dommages à l'ADN et un profilage des voies de mort cellulaire avec leurs cinétiques (voie mitochondriale de l'apoptose dépendante des caspases dans les cardiomyocytes avec autophagie mais sans nécrose) • Etude de l'effet de la Dox sur les niveaux d'expression et d'activité d'EPAC 1 et 2 avec à court terme, une augmentation du niveau d'EPAC et de son activité • Inhibition pharmacologique spécifique de la protéine EPAC1 par un nouvel inhibiteur, identifié au sein du LabEx LERMIT (CE3F4), mais pas celle d'EPAC2, réduit significativement la cardiotoxicité induite par la Dox • Corrélation aux données obtenues in vivo puisque les souris sauvages traitées à la Dox développent une cardiomyopathie dilatée 15 semaines après traitement avec une série d'altérations calciques (2 et 15 semaines), tandis que les souris invalidées pour EPAC1 présentent une homéostasie calcique normalisée et ne développent pas de cardiomyopathie dilatée • Identification d'une partie du mécanisme moléculaire lié à la cardioprotection d'Epac avec implication des voix de transfert (acteurs moléculaires) du calcium 5 Projet détaillé L'ensemble des résultats précédents révèle un effet cardioprotecteur clair de l'inhibition d'EPAC1, il reste les points suivant à savoir : cette cardioprotection est-elle transférée aux cellules tumorales aussi bien in vitro qu'in vivo ? Peut-on protéger le cœur pharmacologiquement parlant par les inhibiteurs en notre possession (commercialement disponibles ou dans le cadre du LabEx LERMIT) sans que la thérapie anticancéreuse ne s'en trouve altérée ? Quel est l'impact au niveau cardiaque de l'ajout d'une pathologie cancéreuse et enfin quelle balance bénéfices/risques peut-on attendre entre un degré suffisant de protection cardiaque et l'atteinte/potentialisation antitumorale dans ce double effet de l'inhibition d'EPAC ? Pour ce faire 2 points principaux vont être abordés et un 3ème optionnel à forte valeur ajoutée dépendant du temps : 1/ Mise en place de nouveaux modèles in vitro et in vivo impliquant la pathologie cancéreuse et donc particulièrement relevant en cardio-oncologie. 2/ Rôle du facteur d'échange EPAC1 dans la cardioprotection et l'activité anti tumorale afin de conserver les effets cytotoxiques des traitements administrés conjointement (chimiothérapie à la Dox déjà caractérisée), voire de les potentialiser. 3/ Optionnel : ouverture des « banc d'essai » in vitro et vivo caractérisés au point 1 aux nouvelles molécules sélectionnées par nos partenaires cliniciens dans le cadre de la proposition Leducq avec une pertinence se basant sur la fréquence d'emploi et la sévérité de la cardiotoxicité observée en clinique. Le travail à réaliser est ambitieux mais toutes les techniques d'évaluation et d'analyse sont déjà réalisées en routine au Laboratoire entre l'équipe 1 énergétique et l'équipe 3 de signalisation et de cardio-oncologie. Les modèles supplémentaires à développer au laboratoire sont maitrisés par notre proche collaboratrice (Dr MC Vozenin, CHUV de Lausanne) qui a déjà assuré des stages de formation. 1/ Mise en place de nouveaux modèles A/ Effets de la Dox et de l'inhibition d'EPAC1 in vitro sur les différentes lignées tumorales Dans un premier temps, les différentes lignées de cellules tumorales mammaires classifiées (HCC1395, HCC1599, HCC1569, BT474, MCF-7 et MDA-MB) seront caractérisées in vitro par cytométrie en flux. Grâce à la sonde FDA (Fluorescéine Di-Acétate), une courbe dose-réponse de mortalité en réponse à la Dox sera effectuée pour chacune des lignées. Les résultats permettront alors de déterminer lesquelles de ces lignées sont répondantes /non répondantes au traitement par l'Anthracycline et quelle sera la dose efficace de Dox à injecter in vivo afin de contrôler la tumeur. B/ Effets de la Dox et de l'inhibition d'EPAC1 in vivo sur souris « nude » injectées par les cellules tumorales Après avoir sélectionné deux lignées tumorales, l'une répondante, l'autre non répondante à la Doxorubicine, des souris « nude » seront injectées par celles-ci en sous-cutanée. Lorsque la tumeur atteindra un volume compris entre 50 et 70 cm3, nous commencerons alors le traitement à la Dox, qui consiste à injecter, en intraveineux, trois doses à deux jours d'intervalle (dose cumulée égale à la dose déterminée in vitro). Ce protocole d'injection de petites doses, en fractionné, nous permet de nous rapprocher le plus possible du modèle utilisé en clinique chez le patient. Ce modèle est relativement rapide à développer et ne requiert pas de technicité élevée avec une analyse simple de suivi de la taille de la tumeur. C/ Effets de la Dox sur un modèle intraductal de cancer mammaire Un dernier modèle intraductal spécifique d'induction de tumeur mammaire sera développé par l'injection dans le canal mammaire de souris de cellules cancéreuses génétiquement modifiées exprimant la luciférase permettant un suivi des tumeurs générées plus profondément par caméra IVIS. Cette implantation plus complexe pour laquelle M. Ribeiro est déjà parti se former chez notre partenaire, est plus relevant cliniquement (production de métastases, agressivité locale) et peut se faire dans des souris WT traitées Dox ou transgéniques (KO) pour EPAC1 permettant une analyse précise du développement tumoral et de la mécanistique de l'altération cardiaque. D/ Au laboratoire seront implantées des IPSC dérivées de patients traités par des thérapies anticancéreuses. Nous les utiliserons alors ponctuellement en complément pour valider les données mécanistiques principales dans des cellules humaines. 2/ Rôle du facteur d'échange EPAC1 dans la cardioprotection et l'activité antitumorale A/ Analyse in vitro : Les lignées cancéreuses traitées à la Dox seront analysées comme précédemment mais cette fois-ci en présence ou absence des inhibiteurs d'EPAC : Ce3F4 et Esi09. Deux inhibiteurs pour deux groupes différents ont été choisis afin de maximiser nos chances ; les 2 étant stables in vitro tandis que l'efficacité in vivo du composé Esi09 et le protocole complet (cinétique/posologie) ont déjà été validés (protocole Almahariq M. et al.15,16).Nous vérifierons donc l'effet cytotoxique d'une inhibition et nous nous attendons à avoir soit 1/ une absence d'effet de l'inhibition de EPAC1 sur la croissance des lignées tumorales suggérant une absence de transfert de la cardioprotection, soit 2/ une mortalité accrue ou alors plus précoce des cellules cancéreuses avec ce traitement suggérant une potentialisation des effets anticancéreux de la Dox. Les données préliminaires sont en faveur de l'option 2 avec une potentialisation de l'effet cytotoxique de la Doxorubicine en présence de Ce3F4 dès la dose de 1 µM de Dox sur les quelques lignées testées, ce qui représente un résultat prometteur. En parallèle, le Dexrazoxane, protecteur cardiaque officiel ne protège, ni ne potentialise la réponse cytotoxique à la Dox de ces mêmes lignées. B/ Analyse in vivo : Deux jours après la fin du traitement anticancéreux, nous passerons à l'étape de l'inhibition pharmacologique d'EPAC. L'efficacité in vivo du composé Esi09 et le protocole complet (cinétique/posologie) ont déjà été démontrés dans les travaux de M.,Almahariq15,16. Les souris seront alors soumises au même protocole strict d'injection quotidienne à 10 mg/kg d'Esi09 en intrapéritonéal. Si les résultats sont concluants, nous envisagerons de répéter le même protocole sur le modèle de souris injectées en intraductal plus complexe en y ajoutant l'inhibition génétique d'EPAC1 de façon à clairement déterminer la mécanistique du rôle de l'inhibition d'EPAC1 dans le cœur. Plusieurs paramètres seront alors ensuite mesurés. Pour la partie cancérologie, la taille de la tumeur sera suivie tous les deux jours avec une mesure au pied à coulisse. Nous nous attendons à une diminution de celle-ci après un traitement à la Dox, et à une diminution semblable voire plus importante lorsque nous inhibons EPAC1. En ce qui concerne la partie cardiaque, des paramètres physiologiques classiques seront mesurés par échocardiographie (fraction d'éjection, volume télédiastolique) et l'homéostasie calcique sera quant à elle analysée par microscopie confocale sur cardiomyocytes isolées avec l'aide du Dr A-M Gomez, experte du domaine. Les résultats obtenus permettront alors de déterminer si les souris traitées à la Dox et à l'Esi09 présentent, d'une part, une réduction de la croissance tumorale en comparaison à des souris non traitées ; et d'autre part, une absence d'anomalie liée au développement d'une cardiotoxicité due au traitement anticancéreux ; modèle pour lequel nous avons déjà un recul important. La compréhension globale des mécanismes sous-jacents identifiés par M. M. Ribeiro et l'intégration avec ceux déjà identifiés dans la littérature (mort cellulaire, altération énergétique, génération de ROS, altération de l'homéostasie calcique, modulation de la voie beta adrénergique, Top II beta) seront réalisés selon les mêmes techniques employées par nos 2 précédents doctorants à savoir microscopie confocale avec mesure de l'ensemble des paramètres calciques, évaluation des dommages histochimiques, profilage des voies de mort cellulaire, mesure de respiration pour l'atteinte énergétique, ou mesure des paramètres biochimiques des acteurs moléculaires de l'ensemble de ces voies. Ces expériences complémentaires nous permettront alors de valider EPAC1 comme une cible thérapeutique de premier ordre dans le cadre d'une amélioration des traitements chimiothérapeutiques combinés à une diminution des effets secondaires cardiotoxiques généralement associés. Mme Belhadef a déjà pris en main les expérimentations et réalisé les premières cinétiques sur cellules tumorales et cultures primaires de cardiomyocytes ; l'apprentissage in vivo est en cours. C'est la raison pour laquelle nous souhaitons garder Mme Anissa Belhadef, une étudiante brillante aussi bien sur le plan de la réflexion que de l'expérimentation, deux qualités indispensables pour faire une bonne thèse. Les différentes méthodologies nécessaires pour terminer cette étude sont parfaitement maitrisées dans l'unité U1180 co-dirigée par R. Fischmeister et A-M. Gomez bénéficiant du soutien du LabEx LERMIT. L'ensemble de ces expériences pourront donc être réalisées dans les meilleures conditions et permettront de valider EPAC1 en tant que nouvelle cible thérapeutique valable à la fois dans le cadre de la cardioprotection contre les Anthracyclines et celui de la cytotoxicité tumorale. 3/ optionnel : test sur «banc d'essai » in vitro et vivo Un panel simple de techniques robustes analysant succinctement chacun des paramètres de l'atteinte cardiaque classique sera réalisé à l'issu de traitements sélectionnés avec les partenaires du Consortium Leducq (HER2, inhibiteur de tyrosine kinase, inhibiteur du protéasome). Nous effectuerons 3 mesures de mort cellulaire pour l'évaluation de la nécrose, apoptose, dommage à l'ADN ; sur l'énergétique (potentiel mitochondrial, activité des complexe de la chaine respiratoire et channeling), des altérations cytologiques (marquage et/coupe type ANF, sarcomérique, etc), de signalisation (quantification calcique et AMPc, EPAC et petites protéines G). Nous mettrons à profit la caractérisation et le recul obtenu sur les modèles de cardio-oncologie précédent ainsi que sur les modèles in vitro d'IPSC cœur de la thématique Leducq. 1. Yeh ETH et al. Cardiovascular complications of cancer therapy : diagnosis, pathogenesis and management. Circulation. 2004 2. Di Marco A, Bertazzoli C. Pharmacology of new basic oligosaccharide antibiotics. Antibiot Chemother. 1963 3. Salazar-Mendiguchia et al. Anthracycline-mediated cardiomyopathy : basic molecular knowledge for the cardiologist. Archiv Cardiol Mexico. 2014 4. Hurria et al. Predicting chemotherapy toxicity in older adults with cancer : a prospective multicenter study. J. Clin. Oncol. 2011 5. Escudier M et al. Clinical Features, Management, and Outcomes of Immune Checkpoint Inhibitor-Related Cardiotoxicity. Circulation. 2017 6. Tebbi CK et al. Dexrazoxane-associated risk for acute myeloid leukemia/myelodysplasic syndrome and others secondary malignancies in pediatric Hodgkin's disease. J Clin Oncol Off J Am Soc Clin Oncol. 2007 7. Zhang et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 2012 8. Doublier S et al. RhoA silencing reverts the resistance to doxorubicin in human colon cancer cells. Moll Cancer Res MCR. 2008 9. Huelsenbeck SC et al. Rac1 protein signaling is required for DNA damage response stimulated by topoisomerase II poisons. J Biol Chem. 2012 10. Li et al. Phosphoinositide 3-Kinase Gamma Inhibition Protects from Anthracycline Cardiotoxicity and Reduces Tumor Growth. Circulation. 2018 11. Morel et al. cAMP-binding protein Epac induces cardiomyocytes hypertrophy. Circ Res. 2005 12. Banerjee U et al. Exchange protein directly activated by cAMP encoded by the mammalian rapgef3 gene : structure, function and therapeutics. Gene. 2015 13. Baljinnyam E et al. Exchange protein directly activated by cAMP increases melanoma cell migration by a Ca2+-dependent mechanism. Cancer Res. 2010 14. Baljinnyam E et al. Epac1 promotes melanoma metastasis via modification of heparan sulfate. Pigment Cell Melanoma Res. 2011 15. Almahariq M et al. A novel EPAC-specific inhibitor supresses pancreatic cancer cell migration and invasion. Mol Pharmacol. 2013 16. Almahariq M et al. Pharmacological inhibition and genetic knockdown of exchange protein directly activated by cAMP1 reduce pancreatic cancer metastasis in vivo. Mol Pharmacol. 2015 17. Murray F et al. Targeting cAMP in chronic lymphocytic leukemia : a pathway-dependent approach for the treatment of leukemia and lymphoma. Expert Opin Ther Targets. 2013 18. Spina A et al. cAMP elevation down-regulates beta3 integrin and focal adhesion kinase and inhibits leptin-induced migration of MDA-MB-231 breast cancer cells. BioResearch Open Access. 2012 19. Monceau V et al. Enhanced sensitivity to low dose irradiation of ApoE-/- mice mediated by early pro-inflammatory profile and delayed activation of the TGFβ1 cascade involved in fibrogenesis. Plos One. 2013 20. Monceau V et al. Epac contributes to cardiac hypertrophy and amyloidosis induced by radiotherapy but not fibrosis. Radiother. Oncol. 2014

  • Titre traduit

    Anticancer therapy induced cardiotoxicity : involvement of EPAC1 in cardioprotection and anti cancer therapy


  • Résumé

    Anticancer therapy induced cardiotoxicity : involvement of EPAC1 in cardioprotection and anti cancer therapy 1/ Context Currently, cancer treatment has undergone major improvements in the diagnostic field and in the efficiency of innovative therapy leading to a significant increase of life expectancy and quality of life for patients. However, the incidence of this disease continues to increase (400,000 new cases of cancer for the year 2017 in France). In the therapeutic arsenal, chemotherapy is highly efficient but raises cardiac toxicity (20% of cases and up to 50% in elderly patient) with a negative impact on overall mortality. Indeed, a clinical trial, in 2015 showed that 51% of cancer survivors died from their cancer but also that 33% died from cardiac pathologies. Anticancer treatment-induced cardiotoxicity is thus a major public health issue. This awareness is illustrated by the settlement of federative structures (International society of Cardio-Oncology, circle of Cardio-Oncology of the SFC, National meeting of Cancer and Heart). Clinically, chronic complications such as arrhythmias and development of heart failure and dilated cardiomyopathy can be observed weeks, months or even years after treatment, thus reducing the overall benefit for the patient. Among the most cardiotoxic agents, the Anthracyclines are broadly used in anticancer chemotherapy and remain unavoidable in the clinic, whereas cardioprotective treatments are almost non-existents. These are antibiotics isolated from streptomyces peucetius in 1963 which promote DNA intercalations. Anthracyclines can also generate high oxidative stress inhibit topoisomerase II alpha leading to tumor cell death. Doxorubicin is a one of the most well-known anthracyclines used in chemotherapy in a wide array of cancer (breast, leukemia, lymphoma, and sarcoma). However, its use can lead to cardiotoxicity pending on the dose, the average frquency is about 20%) leading to a strong decrease in the patient quality of life and increase of its morbi-mortality leading to an overall decrease of the cancer treatment benefits. Frequency could raise also to more than 50% for elderly patients more at cancer risk. Indeed, a clinicla trail performed on 500 patients, 65 years old and more showed that 53% of cancer survivor developed a sever cardiotoxicity in less than 6 months post-treatment (Hurria et al 2011). In clinic, antracyclines-induced cardiotoxicity are arrhythmias and settlement of heart failure and dilated cardiomyopathies that can developp, weeks or even decades post-treatments. This cardiac toxicity is also observed in patient treated by targeted therapy or in the frame of new therapies such as immune checkpoint (Escudier et al 2017). In the frame of chemotherapies, several generation of Anthracyclines have been produced in order to limit or prevent cardiac toxicity. However, these molecules are used at higher concentration in order to manage more accurately cancer pathologies and thus generate the same cardiotoxicity and limits than the older ones. This limit could be overcome by the use of cardioprotective molecules in combination with a more efficient and aggressive chemotherapy with the idea to obtain a higher curative benefit. Today, cardio-prevention against Dox in clinic is weak with only one compound known as the dexrazoxane (with AMM). However is used is highly controversial as it may limit the cancer therapy efficiency, or promote secondary tumors. Thus underlying mechanisms of cardiotoxicity of most of the major anticancer therpay is still not clearly understood. 2/ Overall objectives of the Thesis Thus, the objective of our work is to : 1/ better understand the mechanisms linked to chemotherpaies –induced cardiotoxicity in particular Anthracyclines. 2/ pending on the first point, highlight new signaling pathways or molecules in order to develop new therapeutic treatments that will both limit cardiac pathologies induced by Anthracyclines and keep the cytotoxic effects of cancer treatment on tumor cells or will eventually potentiate it. In order to decrease the field of investigation, we will focused on the exchange factor Epac, well known in cardiac remodeling and cancer more recently. 3/ settle new characterized models as « test bed » of cardio-oncology in which cancer pathologies is present in order to test molecular target identified in the point 2. These test-bed can also be used for the evaluation of new molecules/combined strategies currently used in chemotherapy in clinic. This translational study gather 2 separate domains (cardiology and oncology) that tend to mix more en more. They are both principal axes of LabEx LERMIT since 2011. Moreover, a clinical trialed performed in 2015 showed that 51% of cancer survivor died from their cancer but also that 33% died from cardiac pathologies. Anticancer treatment-induced cardiotoxicity is thus a major public health threat. Indeed, Cancer frequency is increasing in regard to the increasing life expectancy, to the efficiency of new treatment and because treatments are chronic all along life span if necessary instead of a definitive cure. This awareness is also illustrated by the recent settlement of new structures and federative comities such as (International society of cardio-oncology , consortium of cardio oncology of the SFC, national meeting of cancer and the heart). 3/ Current Strategies At the cellular level, Dox is known to generate oxidative stress, DNA intercalation, TOP II inhibition, energetic emergency, the overall leading to cardiomyocytes cell death as written in the Dogma. However, recent data, show that signaling pathways and molecular partners are necessary and sufficient to induce chemo-induced cardiotoxicities. It is the case with the publication in Nature Medecine of the team of ET Yeh from Houston showing in part the novel molecular aspect of antracyclines- induced cardiotoxicity (Zhang et al 2012). In addition, small G proteins such as Rac1 ad Rho A studies are also a good examples in the literature data as their inhibition is sufficient to prevent the Dox cardiotoxicity and may also reverse dox resistance pending on tumor cell types. Research of new therapeutic strategies allowing reduced Dox induced cardiotoxicity without limiting antitumoral activity as thus emerged recently. In addition, one of our close collaborator, Dr A Ghigo from the team of E Hirsch showed very recently that the PI3kinase inhibition only made both lead to cardioprotection advantage as well as a reduced tumor growth (Li et al 2018). This suggest at least at the Research level and not bedside the incoming revolution of positive double sided molecules with a protective action on heart and a second one detrimental on cancer cells in the same time. In our Lab, one of the common activator of the small G proteins involved in antracyclines-induced cardiotoxicity is EPAC. Our team performed pioneering studies showing the role of Epac in the heart and its remodeling capacity. Epac is a GEF directly activated by cAMP as PKA and thus actives directly or indirectly its effectors such as (Rap, Rac, Ras). In cancer, Epac is known to play a major role as its small G effectors are also involved in migration and cellular adhesion and thus in cancer steps such as local tumor invasion and metastasis. In addition, another studies as shown in vitro and vivo that Epac 1 promoted melanoma cell migration in calcium dependent way and that its inhibition prevented partially migration and metastasis. In addition, In vivo Epac inhibition by ESIO9 showed a protection against metastasis development in pancreas cancer. Finally, Epac is known to induce a benefit gain in a leukemia and breast cancer models. Two principals' therapeutic indication for Doxorubicin treatment. 4 / Progress report This project was present at the settlement step of the LabEx LERMIT in 2011 and was labelled « CARDIOTOX 1.3 » and funded (PhD of Miss M Mazevet and working conditions) over 4 years. The main conclusions and contributions are the following : • Long term characterization of a Dox-induced dilated cardiomyoathy • Long term characterization of a radio-induced cardiac hypertrophic model (up to 60 weeks) • Characterization of an in vitro model of neonatal rat cardiomyocytes treated by Dox • Highlight of the Epac1 and not Epac2 in radio –induced cardiac hypertrophy (Monceau et al 2014. Monceau et al 2013) • Role of Rho/CTGF in radio-induced fibrosis • Highlight of the involvement of Epac1 in DNA damages induced by Anthracyclines in cardiomyocyte • Long term characterization of calcium homeostasis under Dox treatment in cardiomyocyte (15 weeks) • Characterization of the biochemical alterations of the calcium homeostasis during this follow-up • Selective alteration of cardiac transcriptional markers following combined therapies. • Tsi work allowed the settlement of teaching activities (ED425) and communication in the frame of TORINO, DU thoracic (head by Pr E Deutsch and B Besse), M2 Bioheart head by Pr B Ghaleh with teaching activities in hospital center of IGR, Bichat, Saint-Antoine. • 3 publications and 2 in preparations, 1 thesis and 1 HDR This first set of settlement allowed au to characterize a new relevant model of cardio-oncology which was present in the Lab before. In additions the conclusions shows that Epac 1 has a central role in Anthracyclines-induced cardiotoxicity. These results as well as Epac1 as a target has been transferred to the axe labelled THreapeutic target T1.1 with the objective to identify /improve new pharmacological therapeutic Epac1 inhibition in the field of hypertrophy/heart failure and in the field of cardio-oncology. This last part is directly in the LabEx LERMIT aim of innovative therapy. This first step allowed the maturation of a second one inside the U1180 Lab with the PhD of Mr M Ribeiro under the supervision of Dr C Lemaire and Dr E Morel. The thesis defend of Mr Ribeiro will be in the end of 2018 with the aim to understand the underlying mechanism of Epac 1 inhibition cardioprotection against Dox side effects and to understand the role of Epac in this context but without cancer pathologies. In that purpose, in vitro and in vivo models have been used: in vivo WT/EPAC1 KO mice(iv injection Dox 12mg/kg) ; in vitro neonatal rat cardiomyocytes (Dox 1microM). During his thesis, Mr Maxance Ribeiro showed the following points : • Characterization of the cell death profiling with full kinetics ( involvement of caspase dependent apoptosis with autophagy without necrosis) • Impact of Dox treatment on Epac1 and 2 expression and activity with an initial increase of both for Epac 1. • Specific pharmacologic inhibition of Epac 1 but not Epac 2 by a LabEx LERMIT inhibitor (CE3F4) decrease Dox-induced cardiotoxicity • This point was correlated with in vivo data as Dox-treated transgenic mice KO for Epac 1 didn't develop dilated cardiomyopathy as observed for Dox treated WT mice. • Highlight of a part of the molecular mechanism of the Epac 1 cardioprotection with the involvement of the calcium channeling between sarcoplasmic reticulum and the mitochondria. 5/ Detailed Project The previous results showed that Epac1 inhibition has a clear cardioprotective effect but we have to know if this protection is transferred to tumor cells in vitro and in vivo. Other additional questions are also remaining: Could we pharmacologically protect the heart with the commercially or in the frame of the LabEx available Epac1 inhibitors without altering the anticancer efficiency of the treatment? What is the impact of the cancer pathology addition on the heart and could we obtained a sufficiently high degree of cardiac protection and keeping at least no effect on the tumor or a treatment potentiation. For that purpose, 2 mains axes will be drawn with a third one which is optional (pending on time) but has a very high added value: 1/settlement of new in vitro and in vivo model including cancer pathologies and thus should highly relevant as cardio-oncologic models. 2/ highlighting the role of Epac1 in the cardioprotection AND in the anti tumoral activity in order to keep benefit of cardioprotection and antitumoral effect (potentiation) in the Dox treatment context already characterized in the 2 previous thesis. These new findings will be integrated in the global understanding of the already known mechanisms of cardiotoxicity. 3/ optional opening of already characterized in vitro and in vivo test bed to new molecules and compounds selected by our clinician partners in the frame of the associated Leducq project. The selection criteria was the frequency and severity of cardiotoxicity among current anticancer treatment. This mass of work is ambitious but all the technics and methods are already routinely performed in the Lab in the existing collaboration between team 1 (energetic) and 3 (ignaling and cardio-oncology). Added model to settle are well known by are expert collaborator Dr MC Vozenin in CHUV Lausanne who has already performed teaching activities to Mr M Ribeiro in that frame. 1/ Settlement of new models A/ Dox and Epac1 Inhibition effects in vitro on various cancer cell lines Firstly, the different cancer cell lines (mammary cancer classified, HCC1395, HCC1599, HCC1569, BT474, MCF-7 and MDA-MB) will be characterized by flux cytometry. Dose response curve with FDA Di-Acetate Fluorescein) in response to Dox for each cancer cell line will be performed. The results will allowed to determine which cancer cell lines are sensitive or not to Dox and the associated DL50. Efficient Dox concentration will be used for in vivo injection in point B B/ Dox Effects and Epac1 inhibition in vivo on nude mice injected with the cancer cells line previously defined. Two cell lines, one responding and one not responding to Dox will be selected and sc injected. After n weeks of tumor development, mice will be treated by the Dox concentration determined in A (3 iv doses separated by 2 days in order to be as close as possible of the procotol in clinic). This model is easily to handle and require only a follow –up of the size of the tumor. C/ Dox effects in an intraductal model of breast cancer. A last model of introduction of transgenic cancer cells (luciferase expression) in the channel of breast will be used. This technic much more difficult to handle is also more relevant in cardio-oncology (fast local progression, metastasis) allowed the follow-up by IVIS analysis of in deep breast tumors. The implantation could be also performed in Epac 1 KO transgenic mice in order to better understand the molecular mechanism of Epac in the heart. This technic was already thought to Mr M Ribeiro by our partner in Lausanne. D/ In the Lab, will be cultured IPSC lines derived from anticancer treated therapies patients. This is a model not developed by ourselves but that will be kindly provided in order to confirm mechanisms data in human cells. 2/ Role of the Epac 1 Exchange factor in cardioprotection AND anti tumoral activities A/ In vitro Analysis : Cancer cell lines treated by Dox will be analysed as previously described in presence or lack of Epac inhibitors (CE3F4 or ESI09) ; 2 different inhibitors in different groups in order to maximize our chance. Indeed, if both compound are effective in vitro this is not the case in vivo as only ESi09 has a clear protocol in vivo (team of Almaharique). Thus, we will check the efficiency of a tumoral cytotoxic effect and we expect 1/ a lack of Epac 1 inhibition effect on the tumor growth suggesting a lack of protective transfer to the tumor 2/ an increased or even earlier mortality of cancer cell lines suggesting a potentiation effect of Epac1 inhibition of Dox treatment on cancer cells. Preliminary data are in favor of the second option with potentiation observed with Dox concentration as low as 1 microM. Interestingly, Dexrazoxane, the official clinic cardioprotector neither show protective effect nor potentiation of Dox treatment on various lines of cancer cells. B/ In Vivo Analysis : Two days after the anticancer treatment, Epac 1 will be pharmacologically inhibited . Efficiency of Epac1 inhibition has been already shown in vivo with the ESI09 compound and thus mices will subjected strictly to the ame protocol with daily ip injection (10mg/kg ESI 09). If the results are conclusive we will repeat the same experimentation on the more complexe intraductal cancer model. The transgenic model of KO Epac 1 will be added at this step in order to determine easily the role of Epac inhibition in the heart. Several parameters will be determined: For the cancer part, size of the tumor will be measured every other day with a sliding caliper. A decrease of the size of the tumor or a growth slow-down is expected after dox treatment. In addition, equal effect or evenly more detrimental effect is expected on the tumor growth in presence of Epac inhibition. For the cardiac part, classical physiological parameters will be determined with Echocardiography (Ejection fraction, telediastolic volume, etc) and calcium homeostasis by confocal microscopy on isolated cardiomycocytes by Dr A-M Gomez expert in this field. The results obtained will allowed us to determine on one side if Dox and Esi09 treated mice show a decrease in tumoral growth in comparison with untreatd mice and on the other side if the heart shows no abnormalities linked to any cardiotoxicity development as observed before (model in which we have a high background). The global understanding of the underlying mechanisms by Mr M Ribeiro and their integration in those already identified in the literature ( cell death, energetic alteration, Ros generation, calcium homeostasis alteration, beta adrenergic modulation, Top II beta degradation) will be performed with the same technics as already used by our 2 previous PhD student which are confocal microscopy ( calcium parameters measurements), histologic alteration, cell death profiling, O2 consumption measurements for mitochondrial activity. Biochemical parameters already identified in all the signaling pathways previously evoked will be assessed. This complementary experimentations will allow us to definitely validate Epac1 as a major therapeutic target with a strong prelinic file in order to increase chemotherapeutic treatment efficiency with a protected heart. This project will be performed by a student which currently master 2 Miss Anissa Belhadef who is under the teaching activities and transfer of knowledge by Mr M Ribeiro. Miss Belhadef already performed the first kinetics on tumor cells and neonatal rat cardiomyocyte. Miss Belhadef is a brilliant student who shows already critical reflexion and practical skills, 2 qualities necessary for a good PhD and carrier. All the methods and technics necessary for this project are aldready performed routinely in the Lab U1180 (head A-M Gomez and R Fischmeister) with the expertise of LabEx LERMIT and foreign collaborators. Thus all these experiments will be performed in the best conditions in order to validate Epac as a good candidate. In cardio-oncology. In perspective, the settled models will be used as test bed to evaluate other compound used in chemotherapy as indicated in point 3 with minimal adaptation and thus a maximum of profitability. 3/ optional: test bed in vitro and in vivo A really simple panel of rugged technics analyzing the well-known parameters of classical cardiac alteration will be performed after cancer selected treatment in the frame of the Leducq consortium (HER2, tyrosine kinase inhibitor, proteasomal inhibitor). We will evaluate measurements of cell death pathways (necrosis, apoptosis, DNA damages, autophagy and ER stress), energetic parameters (mito potential, OXPHOS complexe activities and channeling), cytologic alteration (ANF, sarcomeric, mitochondria staining), of signaling pathways (calcium handling and cAMP, Epac and small G proteins) We will take benefit the characterization and the background we have on the models of cardio oncology as well as on IPSC. 1. Yeh ETH et al. Cardiovascular complications of cancer therapy : diagnosis, pathogenesis and management. Circulation. 2004 2. Di Marco A, Bertazzoli C. Pharmacology of new basic oligosaccharide antibiotics. Antibiot Chemother. 1963 3. Salazar-Mendiguchia et al. Anthracycline-mediated cardiomyopathy : basic molecular knowledge for the cardiologist. Archiv Cardiol Mexico. 2014 4. Hurria et al. Predicting chemotherapy toxicity in older adults with cancer : a prospective multicenter study. J. Clin. Oncol. 2011 5. Escudier M et al. Clinical Features, Management, and Outcomes of Immune Checkpoint Inhibitor-Related Cardiotoxicity. Circulation. 2017 6. Tebbi CK et al. Dexrazoxane-associated risk for acute myeloid leukemia/myelodysplasic syndrome and others secondary malignancies in pediatric Hodgkin's disease. J Clin Oncol Off J Am Soc Clin Oncol. 2007 7. Zhang et al. Identification of the molecular basis of doxorubicin-induced cardiotoxicity. Nat Med. 2012 8. Doublier S et al. 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