Biogenèse et mécanismes régulateurs des ARN non codants longs antisens de levure

par Sara Andus

Projet de thèse en Biologie cellulaire

Sous la direction de Antonin Morillon et de Maxime Wery.

Thèses en préparation à Paris Sciences et Lettres , dans le cadre de Complexité du vivant , en partenariat avec DYNAMIQUE DE L'INFORMATION GENETIQUE : BASES FONDAMENTALES ET CANCER (laboratoire) et de Institut Curie (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-11-2018 .


  • Résumé

    Biogenèse et mécanismes régulateurs des ARN non codants longs antisens de levure Au fil des années, de longs ARN non codants (ARNnc) sont apparus comme des acteurs clés impliqués dans de multiples processus cellulaires, tels que le maintien de la stabilité du génome, la formation de domaines de chromatine ou la régulation de l'expression génique. Soutenant l'idée qu'ils sont fonctionnellement importants, les ARNnc montrent une expression spécifique au tissu et répondent à divers stimuli, suggérant que leur expression est contrôlée avec précision. En outre, plusieurs lncRNA sont déréglés dans des maladies telles que le cancer et les troubles neurologiques. Les ARNnc antisens (as) sont une classe particulière d'ARNnc, qui sont synthétisés à partir du brin d'ADN antisens pour 'détecter' les gènes. Plusieurs exemples de régulation de l'expression génique induite par ARNsnc, en cis ou en trans, ont été décrits dans des cellules de levure, de plantes et de mammifères. Cependant, malgré leur importance réglementaire, les ARNsn ont été peu étudiés et, sauf chez S. cerevisiae, aucune étude systématique n'a encore abordé leur caractérisation fonctionnelle et leur traitement. Une raison du manque d'information globale sur les ARNsn semble être leur faible abondance cellulaire et leur forte hétérogénéité dans l'expression. Par exemple, chez S. cerevisiae, notre laboratoire a décrit une classe d'ARNsn de régulation appelés transcripts instables sensibles au Xrn1 (XUT), car ils sont dégradés par l'exoribonucléase cytoplasmique Xrn1 5'-3 '. De manière intéressante, bien qu'il ait été démontré que la stabilisation d'un sous-groupe d'ARNsnc résulte en une atténuation transcriptionnelle du gène à sens apparié dans une partie discrète de la population cellulaire, les mécanismes régulateurs sous-jacents restent peu clairs à ce jour. Récemment, notre laboratoire a montré que les XUT sont ciblés sur Xrn1 par une voie de désintégration d'ARN spécialisée, connue sous le nom de désintégration médiée par Nonsense (NMD), qui dépend de la traduction. La sensibilité des XUT à la NMD suggère qu'ils pourraient être traduits, posant la question de leur potentiel de codage. D'autre part, il a été montré que les asXUT formaient des structures d'ARN double brin (ds) in vivo avec leurs ARNm appariés, ce qui les protège du NMD. Dans ce contexte, ce projet vise à mieux comprendre le métabolisme et le mécanisme d'action des asXUT, en utilisant comme modèle la levure naissante S. cerevisiae. Pour aborder leur hétérogénéité d'expression et décrypter avec précision les bases et les mécanismes de l'instabilité des XUT, nous cherchons à implémenter systématiquement des approches à la résolution unique de l'échelle cellulaire, des analyses au niveau du locus unique à l'OMIC unicellulaire. Le projet développera deux objectifs: comment contrôler la dégradation de XUT et leur fonction cellulaire à la fois par la machinerie translationnelle (objectif 1) et par la formation de structures double-brin d'hybrides ARN-ADN (objectif 2), en utilisant une combinaison de génome analyses à l'échelle nationale et manipulations génétiques. En bref, le projet traitera à la fois du locus unique et du génome entier. Les petits ORF sont des déterminants clés de la biogenèse des ARNnc non seulement pour créer des peptides fonctionnels, mais aussi pour diriger leur processus de dégradation en ciblant les facteurs NMD. Des expériences de génie génétique classiques couplées à l'analyse du protéome fourniront des aperçus mécanistes fondamentaux sur le paradigme de la dégradation de l'ARN «non codant». Dans le second but, le développement de la technologie DRIP-seq (DNA: RNA hybrid ImmunoPrecipitation Sequencing) combinée avec des mutations sélectionnées affectant la biogenèse ARN: ADN hybrides (R-loop) éclaircira le potentiel de l'ARNnc à affecter l'épigénome. En conclusion, ce projet va mettre en lumière les rôles globaux d'une classe d'ARNs de régulation (XUT) dans un système eucaryotique modèle simple (S. cerevisiae). Les données obtenues aideront à comprendre le (s) rôle (s) et la (les) fonction (s) des ARNsn chez les eucaryotes supérieurs.

  • Titre traduit

    Biogenesis and regulatory mechanisms of yeast antisense long non-coding RNAs


  • Résumé

    Biogenesis and regulatory mechanisms of yeast antisense long non-coding RNAs Over the years, long non-coding RNAs (lncRNAs) have emerged as key players involved in multiple cellular processes, such as maintenance of genome stability, formation of chromatin domains, or regulation of gene expression. Supporting the idea that they are functionally important, lncRNAs show tissue-specific expression and respond to diverse stimuli, suggesting that their expression is precisely controlled. In addition, several lncRNAs are misregulated in diseases including cancer and neurological disorders. Antisense (as)lncRNAs are a particular class of lncRNAs, that are synthesized from the DNA strand antisense to “sense” genes. Several examples of aslncRNAs-mediated regulation of gene expression, in cis or in trans, have been described in yeast, plant and mammalian cells. However, despite their regulatory importance, aslncRNAs have been poorly studied and except in S. cerevisiae, no systematic study has yet addressed their functional characterization and processing. One reason for the lack of global information on aslncRNAs appears to be their low cellular abundance and their high heterogeneity in expression. For instance, in S. cerevisiae, our lab described a class of regulatory aslncRNAs referred to as Xrn1-sensitive Unstable Transcripts (XUTs), as they are degraded by the 5'-3' cytoplasmic Xrn1 exoribonuclease. Interestingly, despite it has been shown that stabilization of a subgroup of aslncRNAs results into transcriptional attenuation of the paired-sense gene in a discrete part of the cellular population, the underlying regulatory mechanisms remain unclear to date. Recently, our lab has shown that XUTs are targeted to Xrn1 through a specialized RNA decay pathway, known as the Nonsense-Mediated Decay (NMD), which depends on translation. The sensitivity of XUTs to the NMD suggests that they could be translated, raising the question of their coding potential. On the other hand, asXUTs were shown to form double-stranded (ds)RNA structures in vivo with their paired-sense mRNAs, and this protects them from the NMD. In this context, this project aims to get further insights into the metabolism and the mechanism of action of asXUTs, using the budding yeast S. cerevisiae as a model. To tackle their expression heterogeneity and precisely decipher step by step the basis and mechanisms of XUTs instability, we aim to systematically implement approaches at the unique cell scale resolution, from analyses at the level of single locus to genome-wide single-cell OMIC. The project will develop two aims investigating how are controlled the XUT degradation and their cellular function both by the translational machinery (aim 1) and by the formation of double-stranded structures from RNA to DNA hybrids (aim 2), using a combination of genome-wide analyses and genetic manipulations. Briefly, the project will address both at the single locus and genome-wide levels how small ORF are key determinants for the lncRNAs biogenesis not only in creating opportunity to produce functional peptides but also to drive their degradation process by targeting the NMD factors. Experiments of classic genetic engineering coupled with proteome analysis will provide fundamental mechanistic insights into the paradigm of “non-coding” RNA degradation. In the second aim, development of DRIP-seq (DNA:RNA hybrid ImmunoPrecipitation Sequencing) technology combined with selected mutations affecting RNA:DNA hybrids (R-loop) biogenesis will shed light into the potential of lncRNA to affect the epigenome. In conclusion, this project will bring lights into the global roles of a class of regulatory aslncRNAs (XUTs) in a simple model eukaryotic system (S. cerevisiae). The data obtained will help paving the way into the understanding of the role(s) and function(s) of aslncRNAs in higher Eukaryotes.