Décrypter les mécanismes d'export des ribonucléoprotéines du virus respiratoire syncytial

par Gina Cosentino

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Marie-Anne Rameix-welti et de Elyanne Gault.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....) , en partenariat avec Infection et Inflammation chronique (laboratoire) et de Université de Versailles-Saint-Quentin-en-Yvelines (établissement de préparation de la thèse) depuis le 02-01-2019 .


  • Résumé

    L'objectif de ce projet est de décrypter les mécanismes d'export des nouveaux virions du virus respiratoire syncytial (RSV). Etat de l'art Le RSV est un agent majeur et ubiquitaire des infections virales respiratoires chez l'Homme. Il est responsable de plus de 33 millions de cas/an de bronchiolite chez l'enfant conduisant à plus de 3 millions d'hospitalisations. Chez l'adulte, les infections par le RSV sont responsables d'une morbidité et d'une mortalité proche de celles de la grippe, touchant essentiellement les sujets âgés ou fragilisés. Il n'existe à l'heure actuelle ni traitement ni vaccin ciblant les infections par le RSV. Le développement de nouveaux antiviraux est un donc un enjeu de santé publique, mais est freiné par un manque de connaissance sur les mécanismes de multiplication du RSV. Le RSV est un virus enveloppé dont le génome est constitué d'un ARN simple brin de polarité négative. Son enveloppe comporte 2 glycoprotéines de surface majeures F et G. L'ARN génomique, encapsidé par la nucléoprotéine N et lié à la polymérase L et ses cofacteurs P et M2-1, constitue la ribonucléoprotéine virale ou RNP. Nous avons récemment établi que ces étapes de synthèse des ARN viraux avaient lieu dans des inclusions cytoplasmiques les corps d'inclusion ou IBs (Rincheval et al. 2017). L'ARN encapsidé sert de matrice pour la production des ARNm viraux (transcription) et de nouvelles RNPs (réplication) destinées à servir à leur tour de matrice ou à former de nouveaux virions. La production des nouveaux virions implique l'export des RNPs des IBs vers les sites de bourgeonnement du virus situés, à priori, à la membrane plasmique. Selon les données publiées, la protéine de matrice M jouerait un rôle clé dans l'assemblage du virion en interagissant vraisemblablement à la fois avec les RNPs et la queue cytoplasmique de F (Mitra et al. 2012; Baviskar et al. 2013). Dans ce modèle, les rôles des protéines virales dans l'export des RNPs restent à préciser. On ne sait toujours pas si M est associée à des RNPs mobiles - comme cela a été suggéré pour la rougeole ou s'assemble autour des RNPs dans une phase ultérieure - comme pour le virus de Marburg. Dans tous les cas, le mouvement des RNPs vers la surface cellulaire nécessite des mécanismes de transport actifs, car la diffusion des gros objets dans le cytoplasme est limitée par l'encombrement moléculaire des organites, le cytosquelette et les fortes concentrations protéiques. Ce transport actif pourrait impliquer le détournement des réseaux d'actine (Shaikh et al. 2012) et/ou le réseau apical de recyclage des endosomes (ARE) impliqué dans le maintien de la polarité cellulaire (Brock et al. 2003; Utley et al. 2008). Ce dernier joue un rôle dans l'exportation des RNPs de différents virus ARN négatifs (tels que la grippe, Sendai, la rougeole et les oreillons). De plus, un crible d'interactomique en microfluidique a révélé une interaction potentielle entre Rab11a, un régulateur clé de l'ARE, et la protéine M. Notre équipe a mis au point un système de génétique inverse original et obtenu récemment le premier RSV exprimant une protéine virale fusionnée à une étiquette fluorescente (Rameix-Welti et al. 2014; Rincheval et al. 2017). Nous mettrons à profit notre capacité à manipuler le génome du RSV pour produire des RSV recombinants exprimant une RNP fluorescente. Ceux-ci nous donneront l'opportunité de suivre les mouvements des RNPs dans des cellules vivantes. L'objectif de ce projet est d'établir comment les RNPs produites dans les IBs sont transportées vers les sites de bourgeonnement du virus à la membrane plasmique en nous appuyant sur ces outils uniques, sur des méthodes d'imagerie avancées et des modèles cellulaires pertinents. Le projet se décompose en 4 parties Le RSV est un agent majeur et ubiquitaire des infections virales respiratoires chez l'Homme. Il est responsable de plus de 33 millions de cas/an de bronchiolite chez l'enfant conduisant à plus de 3 millions d'hospitalisations. Chez l'adulte, les infections par le RSV sont responsables d'une morbidité et d'une mortalité proche de celles de la grippe, touchant essentiellement les sujets âgés ou fragilisés. Il n'existe à l'heure actuelle ni traitement ni vaccin ciblant les infections par le RSV. Le développement de nouveaux antiviraux est un donc un enjeu de santé publique, mais est freiné par un manque de connaissance sur les mécanismes de multiplication du RSV. Notre équipe a mis au point un système de génétique inverse original et obtenu récemment le premier RSV exprimant une protéine virale fusionnée à une étiquette fluorescente (Rameix-Welti et al. 2014; Rincheval et al. 2017). Nous mettrons à profit notre capacité à manipuler le génome du RSV pour produire des RSV recombinants exprimant une RNP fluorescente. Ceux-ci nous donneront l'opportunité de suivre les mouvements des RNPs dans des cellules vivantes. L'objectif de ce projet est d'établir comment les RNPs produites dans les IBs sont transportées vers les sites de bourgeonnement du virus à la membrane plasmique en nous appuyant sur ces outils uniques, sur des méthodes d'imagerie avancées et des modèles cellulaires pertinents. Le projet se décompose en 4 parties 1. Production des RSV recombinants exprimant des RNPs fluorescentes. L'objectif est de produire des virus recombinants dont une protéine de la RNP sera fusionnée avec un « tag » fluorescent (RSV-Fluo-RNP), permettant la visualisation des RNP dans les cellules vivantes. La production de ce type de virus est délicate car la fusion d'une protéine virale avec un tag détruit souvent sa fonctionnalité. L'impact de la fusion sur la fonction de la protéine virale dépend en particulier de la taille du tag et de sa position. Notre stratégie consiste à tester en premier lieu la fonctionnalité des protéines de fusion exprimées transitoirement dans un test de transcription-réplication. Cette méthode permet d'évaluer facilement la fonction de nombreuses constructions (différents tags, différentes positions). Seules les séquences codant pour des protéines fonctionnelles sont ensuite introduites dans le plasmide codant le génome complet pour produire un virus recombinant. Le gène codant la protéine de fusion peut remplacer celui de la protéine sauvage ou être insérer comme un gène surnuméraire. Cette alternative peut permettre d'obtenir un virus viable même si la protéine de fusion n'est pas fonctionnelle. Le virus exprimera alors 2 protéines une sauvage et une fluorescente. En utilisant cette stratégie nous avons déjà produit un virus exprimant une protéine M2-1-GFP (Green Fluorescent Protein) (Rincheval et al, 2017), un virus exprimant une protéine P fusionnée au tag tetracystéine (petit tag visualisable in vivo après marquage) ou à la mCherry (résultats non publiés). Ces virus pourront d'ores et déjà être utilisés dans les parties 2-4. D'autres RSV-Fluo-RNP seront produits en fonction des besoins expérimentaux (notamment tag avec des propriétés différentes). 2. Mise au point d'une méthode de suivi des RNPs fluorescente en cellules vivantes sur cellules épithéliales classiques et polarisées L'objectif est d'analyser les mouvements des RNPs dans des cellules vivantes. A l'heure actuelle les mouvements des à l'intérieur des cellules vivantes n'ont pas été décrits. Notre stratégie consiste à suivre les mouvements des RNP fluorescentes dans des cellules vivantes infectées par un RSV-Fluo-RNPs et de caractériser automatiquement les trajectoires des RNPs. Les RSV-Fluo-RNP constituent des outils de choix car ils comportent plusieurs copies de la protéine fluorescente (entre 400-1200) ce qui permet une amplification du signal. Les acquisitions d'images sur les cellules infectées seront réalisées sur le microscope confocal Leica SP8 de la plateforme d'imagerie Cymages qui est situé dans notre bâtiment et dispose d'une chambre d'incubation à 37°C. Nous avons obtenu le financement d'un scanner résonnant pour ce microscope ce qui permettra d'atteindre des vitesses d'acquisition importantes compatibles avec les vitesses attendues (de l'ordre de 0.2 à 1.2µm/sec) avec une bonne résolution en x, y et z avec une phototoxicité limitée. L'analyse automatisée des trajectoires sera réalisée grâce au logiciel Imaris disponible sur la plateforme. Nous utiliserons dans un premier temps des cellules épithéliales conventionnelles type HEp-2 ou A549. Certaines données suggèrent que les voies de transport des RNPs pourraient dépendre de la polarité cellulaire (Brock et al. 2003). Nous chercherons donc à analyser les mouvements des RNPs dans des cellules proches des cellules ciliées de l'épithélium respiratoire, qui sont les cellules cibles du RSV in vivo. Nous utiliserons en particulier des BCi-NS1, un modèle particulièrement proche des cibles naturelles du RSV. Cette lignée de cellules épithéliales bronchiques humaines récemment décrite est en effet capable de se différencier en interface air-liquide. Nous obtenons au laboratoire un épithélium différencié infectable par le RSV avec 20-40% de cellules ciliées. Grace aux RSV-Fluo-RNPs, nous pourrons analyser les mouvements des RNPs dans des Bci-NS1 infectées. En cas de difficultés techniques pour acquérir des images dans ce modèle, nous aurons recours à des modèles de sphéroïdes ou de culture sur microbilles en utilisant les BCi-NS1 ou éventuellement des MDCK polarisées. 3. Etude des rôles de M et F dans l'export des RNPs L'objectif est de définir le rôle des protéines virales dans l'export des RNPs. La littérature suggérant des interactions entre les RNPs, M et F au cours de ce processus, nous nous concentrerons sur ces protéines. Nous aborderons cette question par 2 stratégies complémentaires 1- Nous caractériserons les mouvements relatifs des RNPs et des protéines M ou F dans des cellules vivantes infectées. Les cellules seront infectées par un RSV-Fluo-RNPs pour visualiser les RNPs. Pour visualiser M/F, nous exprimerons transitoirement une protéine fluorescente (en vérifiant sa colocalisation avec la protéine sauvage sur cellules fixées). Cette stratégie a été employée avec succès pour le virus de Marburg. Une alternative est de visualiser F au moyen de nanobodies dans les cellules vivantes. Ces expériences nous permettront de définir à quel niveau du trajet des RNPs, la M et la F s'associent au complexe. Des expériences d'imagerie sur cellules fixées permettront de préciser ces résultats. 2- Nous mettrons au point un test fonctionnel d'export des RNPs sur le modèle du test de transcription-réplication et de formation des VLP, en exprimant transitoirement un pseudo génome viral et différentes protéines virales dans des cellules (Sourimant et al. 2015; Teng & Collins 1998). Ce test nous permettra d'étudier précisément le rôle de chaque protéine virale indépendamment des autres étapes du cycle de réplication. 4. Etude des voies cellulaires impliquées dans le transport des RNPs L'objectif est d'identifier les voies cellulaires de transport empruntées par les RNPs du RSV et de définir les mécanismes par lesquels le RSV détourne ces voies. Pour identifier les voies de transport utilisées pour l'export des RNPs, nous déterminerons dans un premier temps les grandes voies impliquées puis nous préciserons les protéines ciblées par le virus par des analyses plus spécifiques. Ces investigations spécifiques seront guidées à la fois par les résultats des explorations globales et les données bibliographiques disponibles sur le RSV et sur d'autres virus à ARN négatifs. L'identification des grandes voies impliquées dans le transport reposera sur : 1) l'analyse même des types de mouvements des RNPs (vitesse et direction caractéristiques de certains réseaux), 2) l'analyse de l'effet d'inhibiteurs de différents réseaux sur les mouvements des RNPs (inhibiteurs des réseaux d'actine ou tubuline, inhibiteurs de moteurs moléculaires…) et 3) l'analyse des mouvements relatifs des RNPs et de marqueurs de différents réseaux (protéines rab, transferrine marquée…). Pour préciser les protéines impliquées le trafic des RNPs, nous effectuerons d'abord des criblages à petite échelle en nous concentrant sur la ou les voies générales identifiées ci-dessus. Nous étudierons l'impact sur la multiplication virale et les mouvements des RNPs d'une inhibition spécifique et transitoire l'expression des différentes protéines des voies candidates par ARN interférence. Des études plus approfondies seront menées en fonction des résultats. Le test fonctionnel mentionné dans la partie 3 permettra en particulier de préciser l'impact de la modification de l'expression d'une protéine cellulaire sur l'export des RNPs indépendamment des autres étapes du cycle viral. Conclusion Au total nous préciserons aussi les rôles des protéines virales dans l'export des RNPs et nous identifierons les voies, voir les protéines, cellulaires impliquées dans ce processus. Sur la base de ces données, une analyse plus fine des interactions entre les protéines virales et les protéines cellulaires impliquées pourra être entreprise. Ces travaux ouvriront la voie pour la recherche de nouveaux antiviraux qui cibleraient ces étapes tardives. Plus largement nos travaux ouvriront de nouveaux champs de recherche pour le RSV mais aussi pour d'autres virus importants en santé humaine (Rage, Ebola, Rougeole...).

  • Titre traduit

    Revealing the mechanisms of respiratory syncytial virus ribonucleoproteins export


  • Résumé

    The objective of our work is to determine how the RSV exports the newly produced viral particles. We shall explore these as-yet uncharacterized step in RSV by combining the use of (i) recombinant viruses that we alone are capable of developing, (ii) original cellular models and (iii) advanced imaging technologies. Stat of the art The respiratory syncytial virus (RSV) is a major and ubiquitous agent of respiratory viral infections in humans. It is responsible for more than 33 million cases/year of bronchiolitis in children leading to more than 3 million hospitalizations. RSV is also associated with a substantial disease burden in adults comparable to influenza, with most of the hospitalizations and mortality in the elderly. There are no vaccines or specific antivirals against RSV yet available. As such, it remains a major unmet medical need for most individuals, but is hampered by a lack of knowledge on the multiplication mechanisms of RSV. RSV belongs to the Mononegavirales (MNV), an order of viruses whose genome is constituted by a single negative-sense strand of RNA. RSV envelop contains 2 major glycoproteins the fusion protein F and the glycoprotein G. The 15kb RSV genomic RNA is encapsidated by the nucleoprotein N, and binds to the polymerase complex proteins to form the viral ribonucleoprotein (RNP). We recently established that viral RNA synthesis occurs within cytoplasmic inclusions, referred to as inclusion bodies (IBs) (Rincheval et al. 2017). The encapsidated viral RNA serves as a template for transcription of viral mRNA and for replication leading to production of new RNPs. These may in turn drive viral RNA synthesis or be incorporated in new virions. That requires transporting of the new RNPs from IBs to the plasma membrane, where RSV supposedly buds, forming elongated membrane filaments. According to the published data, the matrix protein M would drive virion assembly by presumably interacting both with the RNPs and the cytoplasmic tail of F (Mitra et al. 2012; Baviskar et al. 2013). In this model, the viral proteins functions in RNPs export remain particularly elusive. It is still not clear whether M is associated with moving RNPs - as has been suggested for measles) or associates RNPs in a later phase - as seen for Marburg virus. In any case, the movement of RNPs to the cell surface require active transport mechanisms, since diffusion of large objects in the cytoplasm is restricted by molecular crowding by organelles, the cytoskeleton and high protein concentrations. This active transport might involve hijacking of the actin networks (Shaikh et al. 2012) or the apical recycling endosome (ARE) network involved in the maintenance of cell polarity (Brock et al. 2003; Utley et al. 2008). The latter has been implicated in RNP export in various viruses (such as the influenza, Sendai, measles and mumps viruses). Moreover, a microfluidic screen revealed a potential interaction between Rab11a, a key regulator of ARE, and the RSV M protein. Our team has developed an original reverse genetics system and recently obtained the first RSV expressing a viral protein fused to a fluorescent tag. This type of virus enables us to explore for the first time the dynamics of viral proteins in living cells. In the present project, we will leverage our skills in genetic manipulation of RSV to produce RSV expressing fluorescent RNPs. These will give us the opportunity to explore a blind spot in RSV multiplication: RNPs exports mechanisms using advanced imaging technology and relevant cellular models. This project is divided in 4 parts. 1. Production of recombinant RSVs expressing a fluorescent RNP Objective: Produce recombinant viruses harbouring a protein fused with a fluorescent label, which will allow the visualization of RNPs in living cells (referred to henceforth as RSV-Fluo-RNP). Engineering this type of construct is challenging because viral fusion proteins often lose their functionality - leading to viruses that are unable to replicate. Functional impact of the fusion depends on the size of the tag and the position of insertion in particular. Approach: Our chosen strategy consists in first testing the transiently expressed fusion protein's function in a transcription-replication assay. This method will enable us to test the functionality of numerous various constructions (various tags, various insertions positions). The sequences coding for functional proteins will be then transferred to the reverse genetics system that we developed (Rameix-Welti et al. 2014). The tagged protein's coding sequence will be used to replace the wild-type protein sequence or alternatively as a supernumerary gene. The second option will enable the rescue of viable virus expressing a fluorescent non-functional protein together with the wild type one. Using the strategy described above, we have already managed to produce a replication-competent, recombinant RSV that expresses the M2-1 protein fused to mGFP (RSV-M2-1mGFP) (Rincheval et al. 2017), two RSV expressing a P fluorescent protein (RSV P-Tetracystein Tag and RSV-P-mCherry; unpublished data). These viruses will be first used in part 2-4 and other will be produced to address specific experimental needs (use of fluorescent tags with various properties). 2. Tracking of RNPs in conventional and polarized epithelial cells Objective: To set up the methods of tracking moving RNP in living cells. There is no report of RSV RNPs tracking inside living cells. Approach: We will image single fluorescent RNPs in living RSV-Fluo-RNP infected cells and automatically track their movements. The RSV-Fluo-RNPs constitute the perfect tool for live tracking of RNPs movements because RNPs contain many copies of the fluorescent protein (around 400-1200) which enables amplification of the signal. Tracking the fluorescent RNPs in real time in infected cells will be performed using a confocal microscope equipped with incubation chamber on Cymages platform in our building. We just obtained the funding by the region Île-de-France (DIM 1HEALTH Equipment) for the upgrade of the confocal microscope from conventional to resonant scanner generating necessary speed for real time imaging of RNPs (expected speeds around 0.2 and 1.2 µm/sec) with high x, y and z resolution and relatively low phototoxicity. The objects will be tracked using powerful algorithms that are now commercially available (Imaris software). Experiments will be first performed in “conventional” epithelial cell lines (HEp-2, A549). Noteworthy RNP trafficking pathway might depend on cell polarity, as suggested by the directional (apical) budding of RSV in polarized epithelial cells (Brock et al. 2003). It will thus be important and distinctive to track viral RNPs in polarized cells closely resembling to RSV natural targets. We will use BCi-NS1 cells that are the first ever epithelial cell line to differentiate into ciliated epithelium when cultured at an air-liquid interface. In our lab, we currently obtain BCi-NS1-derived epithelia with 20-40% of ciliated cells that can be infected by RSV. We will track RNPs in BCi-NS1 infected with RSV-Fluo-RNPs. To overcome potential technical difficulties, we may leverage different models of differentiation of polarized cells (spheroid formation or growth on microcarriers) using MDCK and/or BCi-NS1 cells. 3. Identification of the viral proteins involved in RNP trafficking Objective: To decipher the role of the viral proteins in RSV RNPs export. We will focus on M and F since previous studies suggested interactions between RNPs, M and F. Approach: This will rely on two complementary approaches 1- We will study M and F locations with respect to moving RNPs in living infected cells. Cells transiently or stably expressing an M or an F fluorescent protein will be infected with RSV-Fluo-RNP. Both the RNP and the fluorescent protein will be tracked on living cells. Another option to detect F in living cells would be to use nanobodies. These experiments will allow us to determine at which step M binds to the RNPs, and when the complex associate with F. Imaging experiments on fixed cells will be performed to specify the results. 2- We are going to develop an assay for studying the trafficking of pseudo-RNPs using transient expressed proteins, based on the transcription-replication assay (Sourimant et al. 2015) and a VLP formation assay as described by Teng et al (Teng & Collins 1998). We shall study the movements of the reconstituted pseudo-RNPs by transiently expressing a pseudo-viral RNA together with the N, P, L, M2-1, M and F proteins (including fluorescent proteins), which will enable us to test the importance of the various viral proteins in this precise step independently of the other ones. 4. Identification of the cellular pathways involved in RNP trafficking Objective: To identify the cellular pathways involved in RNP export and to specify the mechanisms by which RSV hijacks the cellular transport network. Identification of the transport pathways hijacked by RSV to transport its RNPs will rely on (i) analysis of elements involved in many different cellular pathways (such as the tubulin network) and (ii) extensive explorations of specific pathways. These specific investigations will be guided by both the results of the global explorations and the available bibliographic data on RSV and on other negative RNA viruses. We will identify of the cellular transport pathways used by RSV RNPs through the analysis of (i) the characteristics of RNPs movements, (ii) the effect of disrupting transport networks on the movements of the RNPs (cytoskeletal network inhibitors, molecular motor inhibitors…).and (iii) the colocalization of moving RNPs with cellular transport network components or cargos (Rab proteins, transferrin…). To study the exact role of cellular proteins part of the identified pathways we will perform small-scale screening(s) by specifically and transiently blocking the expression of the different proteins of candidate pathways by RNA interference in conventional cell lines (and polarized cells if relevant). To probe the roles of the key proteins, we will then carry out detailed studies depending on the results. The functional RNP export assay, mentioned in part 3, will enable us to test the role of a particular cellular protein in RNP export independently of other steps in viral replication. Future perspectives: In this project, we will specify the roles of viral proteins in RNP export and identify cellular proteins involved in RNP trafficking. Moving further ahead, we shall look for interactions between viral and cellular proteins occurring in these steps and seek to identify the viral protein domains involved. This work will open the way to the biochemical and structural characterization of these interactions and thus facilitate the design of corresponding inhibitors of RSV replication. Our data will open up novel opportunities for research on RSV and other MNV viruses pathogenic in humans (Rabie, Ebola, measles)