Traitement du stress et des dommages cellulaires : utilisation de mitochondries saines isolées à partir de cellules de donneurs dans le transfert/greffe artificiel de mitochondries (AMT/T) pour réparer le dysfonctionnement mitochondrial dans des cellules différenciées (cellules mono nucléées du sang périphérique) et germinales (ovocytes)

Treating Cellular Stress and Damage : Use of Healthy Mitochondria Isolated from Donor Cells in the Artificial Mitochondria Transfer / Transplant (Amt/T) to Repair Mitochondrial Disfunction in Differentiated (Peripheral Blood Mononuclear Cells) and Germinal Cells (Oocytes)

• Auteur / Autrice : Francisco Javier Cabrera Aulestia
• Direction : Christian Jorgensen, Andrès Caicedo
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Biologie Santé
• Date : Soutenance le 13/12/2019
• Etablissement(s) : Montpellier en cotutelle avec Universidad San Francisco (Quito, Equateur)
• Ecole(s) doctorale(s) : Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut en médecine régénératrice et de biothérapie (Montpellier)
• Jury : Président / Présidente : John De Vos
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Christian Jorgensen, Andrès Caicedo, John De Vos, Iván M. Moya, Luz Maria Granados V., Marbel Torres Arias, Vanessa Romero
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Iván M. Moya, Luz Maria Granados V.

Mots clés

Mots clés contrôlés

ADN mitochondrial

Mutation (biologie)

Ovocytes

Mitochondries

Mots clés libres

Mitochondrie

Mitoception

Ovocytes

Mutation

Réparation

Cellules mononucléées du sang périphérique

Mitochondria

Mitoception

Oocytes

Mutation

Repair

Peripheral Blood Mononuclear Cells

Résumé

Selon la théorie endosymbiotique, la mitochondrie est un organite dérivé d'une ancienne alpha-protéobactérie qui développa une symbiose avec un ancêtre eucaryote. L'ADN mitochondrial (ADNmt) existe dans des centaines à des milliers d'exemplaires dans chaque cellule et code pour 13 protéines structurelles qui sont des sous-unités de la chaîne respiratoire. Les mitochondries génèrent de l'énergie pour les processus cellulaires en produisant de l'ATP par phosphorylation oxydative. Ils contrôlent également d’autres processus tels que la synthèse de nucléotide et d’hème, l’équilibre rédox, le métabolisme du calcium, la gestion des déchets (urée et ROS) et l’apoptose. Les délétions d'ADNmt, les mutations ponctuelles, les dimères de thymine et les déplétions d'ADNmt sont fortement liés à la maladie chez l'homme et d'autres mammifères. Certaines altérations de l'ADNmt peuvent survenir spontanément pendant le spam de la vie, d'autres peuvent être héritées de la lignée maternelle sous forme de mutations spécifiques. Ainsi, les mutations de l’ADN nucléaire peuvent produire des troubles mitochondriaux car, alors que l’ADNmt code pour 13 protéines, les mitochondries ont besoin de près de 2000 protéines dotées de rôles structurels et fonctionnels. Dans ces cas, un modèle d'héritage mendélien peut être observé. Des altérations de l'ADNmt peuvent être produites par l'exposition à des substances toxiques ou à des rayonnements UV et à haute énergie. Les mutations de l'ADNmt sont cumulatives car les mitochondries sont dépourvues de mécanismes de réparation. Les ADNmt normaux et mutants peuvent coexister dans la même cellule, une condition appelée hétéroplasmie. L'hétéroplasmie permet la persistance d'une mutation par ailleurs mortelle à travers les générations. Les troubles mitochondriaux peuvent apparaître sous forme de myopathies, cardiomyopathies, diabète sucré, l’acidose lactique, hypofertilité féminine, lipodystrophie, neuropathies comme l’autisme ou la maladie d’Alzheimer ou des troubles hématologiques et rénaux. En raison de l'hétéroplasmie, ces troubles peuvent apparaître avec une vaste gamme d'intensités, car l'ADNmt mutant nécessaire pour provoquer un trouble varie selon les organismes, les systèmes organiques et au sein d'un tissu donné, et dépend d'un équilibre délicat entre l'offre et la demande en ATP. Un autre type de problème survient au niveau des tissus soumis à une lésion liée à l'hypoxémie, où les mitochondries jouent un rôle important dans la survie et le rétablissement des cellules. Enfin, le rôle joué par les mitochondries dans la survie et le traitement du cancer est concentré dans de nombreuses recherches.Les troubles mitochondriaux semblent sous la forme d’une large gamme de signes cliniques. Dans la plupart des cas de maladies mitochondriales, le traitement symptomatique améliore légèrement la qualité de vie. La plupart des abords expérimentales cherchent à prévenir ces maladies en réduisant le pourcentage d'ADNmt mutant dans l'embryon par transfert nucléaire. Le transfert/transplantation artificiel mitochondrial (AMT/T) parait comme traitement alternatif. Nous montrons une méthode AMT/T -MitoCeption- dans un modèle cellulaire pour le traitement du trouble acquis de l'ADNmt défié par la radiation UV en usant des leucocytes plus la viabilité de Mitoception pour AMT/T sur des embryons murins. Ces résultats représentent une mise à niveau des applications AMT/T. Nous montrâmes que les leucocytes pouvaient être utilisées comme source de mitochondries et le transfert mitochondrial de multiples donneurs vers des cellules altérées. La MitoCeption usée sur des embryons semble être une méthode sûre pour la AMT/T en utilisant des mitochondries humaines. Des chiots murins saines furent obtenus, indiquant que les mitochondries humaines avaient été retirées des embryons pendant leur développement.

According to the endosymbiotic theory, mitochondria is an organelle derived from an ancient alpha-proteobacteria that developed a symbiosis with a eukaryotic ancestor. Mitochondrial DNA (mtDNA) exists in hundreds to thousands of copies in each cell and encodes for 13 structural proteins which are subunits of respiratory chain. Mitochondria generate energy for cellular processes by producing ATP through oxidative phosphorylation. Also, they control other processes as nucleotide and heme syntheses, redox balance, calcium metabolism, waste management (urea and ROS) and apoptosis. mtDNA deletions, point mutations, thymine dimers and mtDNA depletions are strongly related with disease in humans and other mammals. Some mtDNA alterations can arise spontaneously during life spam, other can be inherited by maternal lineage as specific mutations. So, nuclear DNA mutations can produce mitochondrial disorders because while mtDNA encodes 13 proteins, mitochondria need almost 2000 proteins with structural and functional roles. In these cases, a mendelian inheritance pattern can be observed. mtDNA alterations can be produced by exposure to toxic substances or UV and high-energy radiations. mtDNA mutations are cumulative because mitochondria lack reparative mechanisms. Normal and mutant mtDNA can coexist in the same cell, a condition known as heteroplasmy. Heteroplasmy allows the persistence of an otherwise lethal mutation through generations. Mitochondrial disorders can appear as myopathies, cardiomyopathies, lactic acidosis diabetes mellitus, female’s subfertility, lipodystrophy, neuropathies as autism or Alzheimer’s diseases or haematological and renal disorders. Due to heteroplasmy, these disorders can appear with a wide range of intensities, because the mutant mtDNA needed to cause a disorder varies among organisms, among organ systems and within a given tissue, and depends on a delicate balance between ATP supply and demand. Another kind of problem surges at tissues under hypoxemic-related damage, where mitochondria play an important role in cell survival and recovery. Finally, the role played by mitochondria in cancer survival and treatment is focused in many researches.Mitochondrial disorders have not a single treatment. In the most serious cases of inherited mitochondrial diseases, the supportive treatment only improves the life quality slightly. Nowadays, the most of experimental approaches search prevents the clinical manifestations of these diseases by reducing the mutant mtDNA percentage into the oocyte or the early embryo via nuclear transfer. Artificial Mitochondrial Transfer/Transplant (AMT/T) rises as an alternative to many acquired or inherited mitochondrial disorders, both ex vivo, in vitro and in vivo conditions. The present work shows the variation of an AMT/T method -MitoCeption- in a cellular model for in vitro treatment of acquired mtDNA disorder caused by UV Radiation by using Peripheral Blood Mononuclear Cells (PBMCs) and the feasibility of the same method for ex vivo AMT/T to murine oocytes and early embryos. In the in vitro model of cell damage by UV radiation, the main results represent an upgrading in the applications of AMT/T. We showed that PBMCs could be used as a primary allogeneic mixed source of mitochondria. We also showed that these mitochondria can be transferred in a mix from different donors (PAMM) to UVR-damaged, non-adherent primary cells. Additionally, the duration of the MitoCeption protocol was reduced. On the other hand, Mitoception used on murine oocytes and early embryos probed to be a safe method for AMT/T by using human mitochondrial mix (PAMM). Murine 0ocytes’ and embryos’ exogenous mitochondrial content was observed by fluorescence microscopy and exogenous mtDNA was quantified by qPCR and 2ΔCT method. Finally, healthy murine new-borns were obtained by embryo transfer, probing that human mitochondria were removed from murine cells during embryo’s development after implantation.