polymères de protéine élastine comme motif pour de nouveaux polymersomes fondée sur la conception

par Tingting Zhang

Projet de thèse en Polymères

Sous la direction de Bertrand Garbay.

Thèses en préparation à Bordeaux , dans le cadre de École doctorale des sciences chimiques , en partenariat avec Laboratoire de Chimie des Polymères Organiques (laboratoire) depuis le 03-10-2018 .


  • Résumé

    Polymères de portfolios sont issus de la région hydrophobe peptidique de tropoelastin.ils ont été initialement lancé par d. w. urry (université de birmingham, usa).ils comprennent de multiples répétitions de val - pro - gly - xaa - gly - aminés, où l'invité de résidus acides aminés...) peut être tout sauf la proline.une propriété déterminante des pel en solution aqueuse est leur comportement transmis par une baisse sensible à la température, la température critique de solubilité (lcst), aussi appelée température de transition (tt), résultant d'une modification de l'état d'hydratation réversible des chaînes polypeptidiques de la température conditil'ons.ci - dessous le tt, pel chaînes sont bien hydratée par hydratation hydrophobe et former une bobine conférant à la solubilité totale aléatoire de polypeptide.sur la la solution la température au - dessus du tt, pel hydrophobically s'effondrer en chaînes coacervate des agrégats insolubles pour former une phase conteining 63% d'eau et 37% de polymères de poids.ce phénomène est entièrement réversible.le tt est influencée par la nature des résidus (p. ex. invités où polaires, accusé, hydrophobes) et la longueur de la chaîne.elle dépend également de la concentration de polypeptidiques ainsi que de la nature et de la concentration de sels qui sont présents dans le milieu (tampon phosphate saline). nous avons mis au point une bibliothèque de plus de 30 différents pel, qui varie selon leur longueur, la composition en acides aminés, global charge (point isoélectrique), hydrophobicité et l'architecture (mono bloquer ou di block).la première étape est la conception et le gène codant la synthèse d'un pel artificielle en utilisant des techniques de biologie moléculaire.par la suite, le gène est introduit dans un vecteur de clonage (habituellement un concept dérivé) pour l'amplification.dans cette étape, plusieurs gènes pourraient être réunies afin d'obtenir plus de gènes (20, 40 ou 60 unités de la vpgxg motif) ou de combiner des blocs de nature différente (hydrophobes et hydrophiles par exemple).ceci est réalisé en utilisant une version modifiée de la recurisive directionnelle élaboré par le groupe chilkoti ligature (université de duke, en caroline du nord, États - unis).après avoir vérifié les différents gènes par séquençage de l'adn, ils sont sous - cloné dans un vecteur d'expression (habituellement un animal dérivé).les plasmides correspondantes sont ensuite introduits dans la bactérie escherichia coli (un dérivé de la souche bl21 pour expression recombinante du pel.après la culture des cellules et l'induction de la production de la protéine recombinante par l'iptg outre, les cellules sont récoltées, lyzed par sonication et le pel sont récupérés dans le lysat cellulaire en répétant plusieurs cycles de chauffage et de refroidissement (inverse de transition cyclisme méthode). parmi les actifs importants fournis par recombinaison comparativement aux portfolios de polymères synthétiques sont leur séquence primaire) inhérents monodispersity et exact à forte teneur en eau, ii), iii), de la biocompatibilité et à faible toxicité, et iv) promouvoir l'intégration de séquences bioactifs faciles d'adhérence cellulaire und contrôlée de dégradation. pel copolymères linéaires et covalentes résultant de l'association de deux ou plusieurs couches avec différents pel tts peuvent former des micelles au - dessus de la température critique de micellisation (omc) qui sont stables sur une gamme spécifique de la température.masse moléculaire et la pureté des pel sont évaluées par sds - page analyses.plus de détermination précise de la masse et des modifications post - traductionnelles initiale (p. ex., méthionine, sera obtenu par clivage) analyses (spectrométrie de masse maldi - tof, lc / ms / ms).le tts de portfolios seront déterminées par spectrophotométrie uv - vis, les mesures de la température et de la concentration des examens préalables).les pel sera également soumis à la rmn, sec, tga et dsc analyses. la diversité des pel présente dans notre bibliothèque peut être renforcée par une modification de la post - synthèse du pel, en combinant la biotechnologie classique et de la chimie organique.on va élargir la diversité des structures accessibles en utilisant des polymères techniques post - polymérisation bioconjugation orthogonaux.en effet, nous avons profité de la situation pour incorporer une modification invité de résidus acides aminés fonctionnels, à savoir la méthionine ou de la lysine, pour ensuite modifier les postes à définir précisément les épines dorsales de du pel afin d'introduire pendentif motifs.récemment, deming et collaborateurs (ucla, États - unis) a élaboré une méthode pour modifier la méthionine contenant des polypeptides synthétiques.nous avons utilisé cette stratégie de greffe de sucres (glucose, galactose et du mannose) ou des groupes amines par cliquez chimie sur le résidu mèthionine du pel.on pourrait changer le multivalency index, le sucre ou l'amine de densité.le pel seront ensuite évalués pour modifier leurs propriétés physico - chimiques et biophysiques (rmn analyses, spectrométrie de masse, la diffusion de la lumière). le pel sera soumis à modifier la relation structure - activité de conception pour des études afin de déterminer le meilleur des ligands des récepteurs contraignant (cas de la formation des complexes glycosylé pel) ou avec des acides nucléiques tels plasmides ou arni (amine modifiés pel).la solubilité dépendant de la température des pel sera également exploité à la conception diblock amphiphiles à préparer des nano - particules assemblés.en outre, ces modèles peuvent également être utilisés pour l'affichage des motifs pendants différents pour des applications biomédicales, telles les cellules des peptides spécifiques pour la production de matériaux pour l'ingénierie tissulaire et de la médecine régénérative.

  • Titre traduit

    Protein-like polymers based on elastin motif for new polymersomes design


  • Résumé

    ELPs are peptide polymers derived from the hydrophobic region of tropoelastin. They were initially pioneered by D.W. Urry (University of Birmingham, USA). They consist of multiple repeats of Val-Pro-Gly-Xaa-Gly pentapeptides, where the guest residue (Xaa) can be any amino acid except proline. A defining property of ELPs in aqueous solution is their temperature-sensitive behavior conveyed by a lower critical solubility temperature (LCST), also called transition temperature (Tt), resulting from a reversible modification of the hydration state of polypeptide chains with temperature conditions. Below the Tt, ELP chains are fully hydrated by hydrophobic hydration and form a random coil conferring total solubility to the polypeptide. Upon raising the solution temperature above the Tt, ELP chains hydrophobically collapse into insoluble aggregates to form a coacervate phase containing 63% water and 37% polymer by weight. This phenomenon is fully reversible. The Tt is influenced by the nature of the guest residue Xaa (e.g. polar, charged, hydrophobic) and chain length. It also depends on the polypeptide concentration as well as the nature and concentration of salts that are present in the medium (Phosphate Buffer Saline). We have developed a library of more than 30 different ELPs, which varies according to their length, amino acid composition, global charge (isoelectric point), hydrophobicity and architecture (mono-block or di-block). The first step is the design and the synthesis of an artificial ELP-coding gene using molecular biology techniques. Thereafter, the gene is introduced in a cloning vector (usually a pUC derivative) for amplification. From this step, several genes could be linked together to obtain either longer genes (20, 40 or 60 units of the VPGXG motif) or to combine blocks of different nature (hydrophobic and hydrophilic for example). This is achieved by using a modified version of the Recursive Directional Ligation developed by the Chilkoti's group (Duke University, North Carolina, USA). After verifying the different genes by DNA sequencing, they are sub-cloned in an expression vector (usually a pET derivative). The corresponding plasmids are then introduced in the bacteria Escherichia coli (a derivative of the BL21 strain) for recombinant expression of the ELP. After cell culture and induction of the production of the recombinant protein by IPTG addition, cells are harvested, lysed by sonication and the ELP are recovered from the cell lysate by repeating several cycles of heating and cooling (Inverse Transition Cycling method). Amongst the significant assets provided by recombinant ELPs as compared to synthetic polymers is their i) inherent monodispersity and exact primary sequence, ii) high water content, iii) biocompatibility and low toxicity, and iv) facile integration of bioactive sequences promoting cell adhesion and controlled degradation. ELP block copolymers resulting from the linear and covalent association of two or more ELP segments with different Tts can form micelles above a critical micellization temperature (CMT) that are stable over a specific range of temperature. Molecular mass and purity of ELPs are evaluated by SDS-PAGE analyses. More precise determination of the mass and putative post-translational modifications (e.g. initial methionine cleavage) will be obtained by mass spectrometry analyses (Maldi-Tof, LC/MS/MS). The Tts of ELPs will be determined by UV-Vis spectrophotometry measurements (temperature and concentration screenings). ELPs will also be subjected to NMR, SEC, TGA and DSC analyses. The diversity of ELP present in our library can be further enhanced by post-synthesis modification of the said ELP, by combining biotechnology and classical organic chemistry. We will broaden the diversity of accessible polymer structures by using post-polymerization orthogonal bioconjugation techniques. Indeed, we took advantage of the modified guest residue position to incorporate a functional amino acid, namely methionine or lysine, to subsequently modify ELP backbones at precisely defined positions so as to introduce pendant motifs. Recently, Deming and collaborators (UCLA, USA) developed a method to modify methionine-containing synthetic polypeptides. We used this strategy to graft sugar residues (glucose, galactose, and mannose) or amine groups by click chemistry on the Methionine residue of our ELP. We could now change the multivalency index, the sugar or amine density. The modified ELPs will then be evaluated for their physicochemical and biophysical properties (NMR analyses, mass spectrometry, Diffusion Light Scattering)). The modified ELPs will be subjected to structure-activity relationship studies to determine optimal ligand design for receptors binding (case of glycosylated ELP) or the complex formation with nucleic acids such as plasmids or siRNA (amine-modified ELP). The temperature-dependent solubility of ELPs will also be exploited to design amphiphilic diblock to prepare self-assembled nano-particles. In addition, these ELPs may also be used to display different pendant motifs for specific biomedical applications, such as cell-specific peptides for the generation of biomaterials for tissue engineering and regenerative medicine.