Etude des mécanismes d'épissage dans le gène DMD et de leurs rôles comme modificateurs de la sévérité de la dystrophie musculaire de Duchenne.

par Dylan Da Cunha

Projet de thèse en Biologie Santé

Sous la direction de Sylvie Tuffery-giraud.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....) , en partenariat avec LGMR - Laboratoire de Génétique de Maladies Rares (laboratoire) et de Rôle des éléments cis-régulateurs de l'épissage en pathologie humaine (equipe de recherche) depuis le 15-10-2018 .


  • Résumé

    Le gène DMD (Duchenne Muscular Dystrophy) dont les mutations sont responsables de la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD) et de Becker (BMD), code pour la dystrophine, une protéine essentielle au maintien de l'intégrité de la cellule musculaire. La régulation de l'expression de ce gène immense (2.2 megabases contenant 79 exons et de très grands introns) reste mal connue, en particulier l'épissage de son ARN pré-messager. La régulation spatio-temporelle du processus d'épissage est complexe. En dehors des sites donneurs et accepteurs consensus d'épissage, un grand nombre de séquences auxiliaires d'épissage distribuées dans les exons et les introns participent à la reconnaissance des exons. Ces séquences fixent des protéines de liaison à l'ARN (RBPs) pouvant avoir un effet activateur ou répresseur de l'épissage selon leurs positions par rapport à l'exon, la spécificité tissulaire, l'état de différenciation cellulaire ou encore le stade de développement. L'équipe a pu montrer récemment que dans le muscle squelettique, les 79 exons du gène DMD étaient constitutifs contrairement à ce qui peut être observé dans les autres isoformes de la dystrophine. Néanmoins, les acteurs de cette régulation restent à identifier. L'objectif de mon projet de thèse est de caractériser les mécanismes moléculaires qui contribuent à la reconnaissance des exons DMD et leur inclusion dans le transcrit musculaire mature. Deux axes seront développés. Nous étudierons d'une part le rôle de RBPs identifiées par l'équipe grâce à un crible fonctionnel, notamment les ARN hélicases, dans le processus d'épissage de DMD en condition physiologique. Par ailleurs, nous chercherons à élucider les bases moléculaires des épissages alternatifs (en phase) observés pour certains exons centraux du gène porteurs de mutation non sens, qui permettent d'atténuer la sévérité de la maladie chez les patients. Nous analyserons plus spécifiquement le rôle des protéines SR dans la détermination du taux de transcrits alternatifs et la modulation du phénotype. Des analyses bioinformatiques (prédictions de sites de fixation de protéines à l'ARN, de structures secondaires de l'ARN) et fonctionnelles (surexpression/inhibition de l'expression de RBPs) seront réalisées dans une lignée cellulaire musculaire humaine normale C25cl48. Le profil d'épissage sera déterminé directement sur le transcrit DMD endogène ou à partir de minigènes rapporteurs d'épissage d'exons de DMD (sauvages ou mutés) transfectés dans les cellules. Des approches biochimiques (RNA pull-down, RNA_EMSA, RIP) permettront d'étudier les interactions ARN-protéines et de définir les sites de fixation des RBPs sur l'ARN qui seront ensuite validés sur le plan fonctionnel par des expériences de mutagénèses dirigées en minigènes. En dehors de l'intérêt de contribuer à une meilleure connaissance de ce processus cellulaire fondamental pour l'expression des gènes, le décryptage des mécanismes moléculaires impliqués dans l'épissage du pré-ARNm de DMD est utile dans le cadre des stratégies thérapeutiques actuelles développées pour la DMD basées sur la redirection de l'épissage.

  • Titre traduit

    Unravelling molecular mechanisms of DMD gene splicing regulation and their roles as disease modifiers in Duchenne muscular Dystrophy.


  • Résumé

    The DMD gene (Duchenne Muscular Dystrophy) encodes dystrophin, a protein essential to maintain the integrity of the muscle cell. Mutations in this huge gene that contains 79 exons and extremely large introns are responsible for Duchenne (DMD) and Becker (BMD) muscular dystrophies. The regulation of its expression remains poorly known, in particular the splicing of its pre-messenger RNA. Spatiotemporal regulation of the splicing is a very complex process. In addition to the consensus donor and acceptor splice sites, a large number of auxiliary splicing sequences are distributed in the exons and introns and participate in exon recognition. These sequences bind to RNA Binding Proteins (RBPs) that can have an activating or repressing effect on splicing in a context- and cell-type-dependent manner. Recent data from the team showed that unlike other dystrophin isoforms, the 79 exons are constitutively spliced in the mature transcript in skeletal muscle. Nevertheless, the actors of this regulation remain to be identified. The PhD project aims to provide a better understanding of the molecular mechanisms controlling DMD pre-mRNA splicing in skeletal muscle. Two complementary axes will be developed. On the one hand, we propose to explore the mechanisms by which some RBPs, and in particular RNA helicases, contribute to the correct inclusion of DMD exons in the mature transcript in physiological condition. On the other hand, part of my PhD work will be done in a pathological context to elucidate the mechanisms underlying alternative splicing of central (in-frame) exons harboring nonsense mutations and attenuate disease severity in some patients. More specifically, we will investigate the role of SR proteins in exon skipping levels and clinical outcomes. To reach our objectives, we will perform bioinformatics studies (prediction of RBP binding mortifs, secondary RNA structures) and functional studies (overexpression/knockdown of RBPs) in a human normal muscular cell line. The splicing pattern of either the endogenous DMD transcript or splicing reporter minigenes of DMD exons will be analyzed. In addition, biochemical assays (RNA pull-down, RNA_EMSA, RIP) will be carried out to identify RNA-protein interactions, and further functionally validated by site-directed mutagenesis in splicing reporter minigenes. Besides the interest of contributing to a better understanding of this fundamental cellular process for the gene expression, the deciphering of the molecular mechanisms involved in the DMD pre-mRNA splicing is useful in the context of the current therapeutic strategies based on splice redirection developed for DMD.