Nouvelles approches électrocinétiques et analytiques pour la détection de biomarqueurs dans les exosomes cellulaires: vers un diagnostic précoce de la sclérose latérale amyotrophique

par Marco Morani

Projet de thèse en Chimie

Sous la direction de Myriam Taverna.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Sciences Chimiques : Molécules, Matériaux, Instrumentation et Biosystèmes , en partenariat avec Institut Galien Paris-Sud (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2018 .


  • Résumé

    La sclérose latérale amyotrophique (SLA) est une maladie neurodégénérative fatale avec une prévalence de 6-7 / 100000 en Europe, dans laquelle la dégénération des neurones moteurs supérieurs et inférieurs provoque une paralysie musculaire progressive [1]. La plupart des patients meurent dans les 2 à 4 ans après les premiers symptômes en raison de complications liées à une altération de la fonction respiratoire [2]. L'absence de thérapeutiques efficaces soulève un besoin de compréhension du mécanisme et surtout d'un diagnostic précoce de cette maladie afin de découvrir de nouveaux traitements. Les biomarqueurs potentiels les plus cités pour la SLA sont les neurofilaments [1]. Néanmoins, aucun des biomarqueurs potentiels de la SLA n'a pu être appliqué avec succès à des fins de diagnostic [3]. Récemment, un intérêt particulier s'est porté vers la protéine TDP-43 (transactive response DNA binding) présente dans le liquide céphalo-rachidien (CSF) car une concentration anormalement élevée a été retrouvée chez les patients SLA [4]. Cependant, plusieurs défis doivent encore être surmontés pour que la pertinence de la TDP-43 comme biomarqueur de diagnostique puisse être démontrée. Les exosomes sont des structures vésiculaires extracellulaires (50-150 nm en diamètre) sécrétées par toutes les cellules des fluides corporels. Ils sont aujourd'hui considérés comme une nouvelle source d'information pour le diagnostic et la découverte de biomarqueurs, car ils transportent des éléments cellulaires spécifiques tels que les lipides, protéines et matériel génétique pouvant refléter la progression d'une maladie. Cependant, plusieurs difficultés sont à surmonter pour isoler efficacement les exosomes et analyser ensuite les espèces exosomales. La méthode établie pour l'isolement des exosomes, l'ultracentrifugation, prend du temps (4-5 h), et conduit à des rendements de récupération très modestes [5]. La détection sensible des biomarqueurs / espèces exosomales constitue également un autre défi. L'ELISA a souvent été la méthode de choix. Cependant cette méthode souffre d'une limite liée à la réaction croisée des anticorps soulevant le besoin de développer de nouvelles approches analytiques. Le but du projet est donc de développer une nouvelle approche analytique pour la séparation et la détection de la TDP-43 exosomale avec un fort potentiel de standardisation, visant à surmonter les défis mentionnés. La puissance de l'immunocapture par des billes magnétiques [6, 7] sera exploitée pour la capture des exosomes et l'enrichissement de la TDP-43 exosomale. Un protocole de traitement d'échantillons en plusieurs étapes sera développé pour i) l'isolement des exosomes en utilisant des billes magnétiques greffées avec des anticorps anti-exosomes, ii) la libération efficace de la TDP-43 à partir d'exosomes immobilisés et iii) l'enrichissement de la TDP- 43 sur des billes magnétiques greffées avec des anticorps anti-TDP-43. Ceci sera suivi par le développement d'une méthode de détection « anticorps-free» de la TDP-43 et de ses formes modifiées pathologiquement en utilisant des techniques de séparation électrocinétiques. L'électrophorèse capillaire (EC) couplée à la détection de fluorescence induite par laser ou à la détection par spectrométrie de masse sera l'option préférée. La performance du protocole développé intégrant le traitement de l'échantillon basé sur la magnéto-immunocapture et la séparation électrocinétique sera évaluée en collaboration avec une équipe de cliniciens neurologues en Allemagne spécialisée dans les maladies neurodégénératives. Afin de mettre en évidence les caractéristiques avantageuses de cette nouvelle méthode en termes de précision, de temps d'opération et de robustesse, la comparaison interlaboratoire sera mise en œuvre en utilisant à la fois les approches développées et l'ELISA existant. Dans une étape plus avancée, l'étudiant ira vers le développement d'un dispositif compact adaptable au contexte hospitalier, en automatisant et intégrant toutes les étapes. Cet outil sera basé sur un nouveau concept de ‘Lab-on-Droplet'. Parallèlement, la caractérisation complète et exhaustive de la TDP-43 exosomale pour identifier ses caractéristiques structurelles spécifiques dans les exosomes sera également étudiée en utilisant principalement des approches de spectrométrie de masse en couplage éventuel à de l'UPLC ou EC pour conduire à un diagnostic plus précis de la SLA.

  • Titre traduit

    Novel electrokinetic and analytical approaches for detection of biomarkers in cell exosomes: towards early diagnosis of amyotrophic lateral sclerosis (ALS)


  • Résumé

    Amyotrophic lateral sclerosis (ALS), with the prevalence of 6-7 / 100000 in Europe, is a fatal neurodegenerative disease in which degeneration of upper and lower motor neuros causes progressive muscular paralysis [1]. Most patients die within 2-4 years after first symptoms due to complications related to impairment of respiratory function [2]. The absence of effective therapeutics raises a need for mechanism understanding and especially early diagnosis of this disease in order to discover new treatments. The most cited potential biomarkers for ALS are neurofilaments [1]. Nevertheless, none of ALS potential biomarkers have been successfully applied in clinical practice [3]. Recently particular attention has been being paid to transactive response DNA binding protein 43 kDa (TDP-43) especially in cerebrospinal fluid (CSF) as its abnormally high concentration was found in ALS patients [4]. However, several bottlenecks still need to be overcome before the diagnostic significance of TDP-43 can be achieved. Exosomes are extracellular vesicular structures (50–150 nm in diameter) secreted by all cells in the body fluids. They are nowadays considered new sources of information for diagnosis and biomarker discovery as they carry cell-specific cargos such as lipids, proteins and genetic materials that may reflect disease progression. The isolation of exosome and analyses of exosomal species on the other hand are still facing several hurdles. The established method for exosome isolation, i.e. ultracentrifugation, is time consuming (4-5 h), while offering very modest recovery yields [5]. Sensitive detection of exosomal biomarkers / species is also another challenge. ELISA has recently been the preferred method for such purposes. This method nevertheless suffers from the limitation of large sample volume consumption and a risk of cross antibody-activity associated with immuno-assay based detection. This raises a need for development of new analytical approaches. The goal of the project is therefore to develop a novel analytical approach for separation and detection of exosomal TDP-43 with a high potential for standardization, aiming at overcoming the aforementioned bottlenecks. The power of magnetic bead-based immunocapture [6, 7] will be exploited for efficient capture of exosomes and enrichment of exosomal TDP-43. A multi-stage sample treatment protocol will be for the first time developed for i) exosome isolation using magnetic beads grafted with anti-exosomal antibodies, ii) efficient release of TDP-43 from on-bead immobilized exosomes and iii) enrichment of TDP-43 onto magnetic beads grafted with anti-TDP-43 antibodies. This will be followed by antibody-free detection of TDP-43 and its pathologically altered forms using resolute electrokinetic separation techniques in order to eliminate the cross-activity problem associated with immunoassay based detection. Capillary electrophoresis (CE) coupled with laser-induced fluorescence or mass spectrometric detection will be considered as the preferred options. The performance of the developed protocol integrating the magneto-immunocapture based sample treatment and electrokinetic separation steps will be evaluated in collaboration with a team of neurologist clinicians in Germany specialized in neurodegenerative diseases. In order to highlight the advantageous features of the newly developed method in terms of accuracy, operation time and robustness, interlaboratory comparison will be implemented using at the same time the newly developed and the existing ELISA approaches. In a more advanced stage towards development of a compact device with automation of all integrated steps and adaptable to the hospital context, down-scaling the established chemical approach into a novel concept of Lab-on-Droplet platform will be envisaged, allowing the tracing of exosomal TDP-43 with only 1 µL sample. In addition full and exhaustive characterization of the exosomal TDP-43 to point out its specific structural characteristics (post translational modification, for example) in biological matrices will be also investigated using mostly MS approaches to lead to more accurate picture of ALS likelihood.