Rôle des Annexines dans la réparation membranaire des cellules musculaires squelettiques humaines

par Coralie Croissant

Projet de thèse en Biologie Cellulaire et Physiopathologie

Sous la direction de Anthony Bouter.

Thèses en préparation à Bordeaux , dans le cadre de Sciences de la Vie et de la Santé , en partenariat avec Chimie et Biologie des Membranes et des Nanoobjets (Bordeaux) (laboratoire) et de Vésicules Extracellulaires et Réparation Membranaire (equipe de recherche) depuis le 03-10-2016 .


  • Résumé

    Les dystrophies musculaires englobent un groupe de maladies musculaires d'origine génétique qui sont caractérisées par une faiblesse et une atrophie progressive des muscles squelettiques. Parmi ces pathologies, la dystrophie musculaire des ceintures de type 2B (LGMD 2B), également appelée myopathie de Miyoshi, est caractérisée par des mutations du gène codant pour la dysferline, conduisant à des dysfonctionnements cellulaires sévères, incluant un défaut de réparation membranaire. La rupture de la membrane plasmique, induite par des stress mécaniques –telle que la contraction musculaire-, est un événement physiologique fréquent dans les fibres musculaires. La rupture membranaire conduit à une entrée dans les cellules de Ca2+ à une concentration de l'ordre du mM. L'augmentation intracellulaire en Ca2+ active une machinerie protéique, qui assure la réparation rapide du sarcolemme. La liste exhaustive des protéines impliquées dans cette machinerie et les processus moléculaires associés restent à établir. La famille des annexines (Anx) est constituée de 12 protéines solubles chez les mammifères, appelées AnxA1 à A13 (le numéro 12 n'est pas attribué). Les Anx partagent la propriété de se lier aux membranes exposant des phospholipides chargés négativement de façon Ca2+ dépendante. Si la liaison est peu dépendante de la tête polaire du lipide anionique, la concentration en Ca2+ requise pour la liaison est très variable entre les différentes Anx. Il a été montré que les AnxA1 et AnxA2 participent à la réparation membranaire du muscle squelettique murin. Avec l'AnxA6, elles sont également impliquées dans la réparation membranaire du muscle squelettique chez le poisson zèbre. De plus, une isoforme atypique de l'AnxA7, dont le trafic subcellulaire est altéré, a été identifiée dans les souris mdx, un modèle génétique de la dystrophie musculaire de Duchenne. Le groupe dirigé par A. Bouter, dans lequel je souhaite effectuer ce projet de thèse, a montré que la réparation membranaire des cellules musculaires squelettiques humaines requiert l'AnxA5. Le projet de thèse a pour objectif 1) d'identifier les Anx impliquées dans la réparation membranaire du muscle squelettique humain, 2) d'élucider la fonction de chacune d'entre elles dans ce processus et 3) d'analyser le comportement des Anx dans des cellules musculaires humaines dystrophiques. A cette fin, nous combinerons un large panel de techniques complémentaires, qui sont pour la grande majorité maitrisées au laboratoire. • La présence des AnxA1 à A13 dans les myoblastes et myotubes de la lignée cellulaire saine LHCN-M2 sera analysée par western blot. Cette lignée cellulaire a été établie à partir de cellules satellites du muscle grand pectoral d'un sujet adulte et est fournie par le Centre de recherche en Myologie (Paris, France). • Afin d'étudier la capacité de réparation membranaire des cellules musculaires squelettiques humaines, le sarcolemme des myotubes LHCN-M2 sera endommagé par irradiation laser. La réparation membranaire sera analysée par le suivi cinétique de l'entrée d'une sonde fluorescente (FM1-43), selon un protocole établi dans le laboratoire. Les conséquences liées à l'absence de chaque Anx endogène sur la réparation membranaire des myotubes LHCN-M2 seront examinées par cette méthode et par microscopie électronique à transmission (TEM). • Des expériences de TEM et d'immuno-TEM seront réalisées afin d'analyser à haute résolution la distribution subcellulaire des Anx dans les myotubes sauvages endommagés et d'étudier les remaniements membranaires dans les myotubes déficients en Anx endommagés. • Il est établi que des mutations du gène codant pour la dysferline conduisent au développement de la dystrophie musculaire LGMD2B, résultant d'un défaut de réparation membranaire. De plus, des mutations dans le gène codant pour la cavéoline-3 conduisent au développement de la dystrophie musculaire LGMD1C, dont l'origine suspectée serait également un défaut de réparation membranaire. Nous analyserons les lignées cellulaires 578, déficiente en dysferline, et 650, déficiente en cavéoline-3, qui ont été établies à partir du muscle vaste latéral de patients souffrant respectivement de LGMD2B et de LGMD1C. Nous déterminerons si les deux lignées cellulaires sont capables ou non de réparer des dommages membranaires. Nous analyserons également le comportement des Anx dans ces cellules endommagées. A terme, les résultats obtenus devraient permettre de mieux comprendre la composition et les mécanismes de la machinerie de réparation membranaire dans le muscle squelettique et pourraient ouvrir des pistes pour des applications thérapeutiques.

  • Titre traduit

    Role of Annexins in membrane repair of human skeletal muscle


  • Résumé

    Muscular dystrophy encompasses a group of genetic disorders that cause progressive weakness and wasting of skeletal muscle. Among these, limb girdle muscular dystrophy type 2B (LMGD2B), also named Miyoshi myopathy, is characterized by mutations in the dysferlin gene leading to several dysfunctions including a failure in cell membrane repair process. Cell membrane disruption is a physiological phenomenon induced by mechanical stress -due to contraction- in muscle fibres, which leads to the entry into cells of extracellular Ca2+ at mM concentration. Increase of intracellular Ca2+ concentration activates the repair protein machinery in eukaryotic cells ensuring a rapid resealing of large cell membrane ruptures. The exhaustive list of components of the repair machinery and their interplay remain to be established. The presence of different annexins (Anx) in skeletal muscle, together with the participation of several members of the Anx family in membrane repair processes, raise the question of a collective role of these proteins in the protection and repair of sarcolemma injuries. The Anx family consists of twelve soluble proteins in mammals, named AnxA1 to A13 (the number 12 is non-assigned). Anx share the property of binding to membranes exposing negatively charged phospholipids in a Ca2+-dependent manner, with little specificity for anionic lipid head-groups, yet the Ca2+ concentration required for binding varies considerably between Anx. AnxA1 and AnxA2 have been shown to participate in membrane repair of mouse skeletal muscle cells. They are also implicated in sarcolemma repair in zebrafish, together with AnxA6. In addition, a muscle-atypic isoform of AnxA7, with altered subcellular trafficking properties, has been reported in mdx mouse, a genetic model for Duchenne Muscular Dystrophy. The group of Dr A. Bouter, in which I am applying for the PhD fellowship, showed that membrane resealing in human skeletal muscle cells requires AnxA5. The PhD project aims 1) at identifying Anx that are essential for membrane repair in human skeletal muscle cells, 2) elucidating the function of each Anx in this process and 3) analyzing Anx in dystrophic muscle cells. For this purpose, we will combine a broad set of complementary methods, most of them well mastered by Bouter's group. • The presence of AnxA1 to A13 in myoblasts and myotubes of the healthy LHCN-M2 cell line will be analyzed by western blot. This cell line has been established from satellite cells of pectoralis major adult muscle and has been provided by the platform for immortalization of human cells from the Center of Research in Myology (Paris, France). • In order to investigate the membrane repair ability of human skeletal muscle cells, plasma membrane of LHCN-M2 myotubes will be damaged by laser irradiation. Membrane repair will be assayed by monitoring the kinetics of cell entry of membrane-impermeable FM1-43 dye, according to a method previously designed by the group. The consequences of the absence of endogenous Anx on membrane repair of LHCN-M2 myotubes will be examined by this method as well as by transmission electron microscopy (TEM). • TEM and immuno-TEM experiments will be performed in order to analyze in detail the subcellular localization of Anx in damaged wild-type myotubes and the consequences of the absence of Anx in damaged Anx-deficient myotubes, on the membrane shuffle at the disruption site. • It has been clearly established that mutations in the dysferlin gene induce a failure in cell membrane repair process, leading to the development of LGMD2B. In addition, mutations of caveolin-3, which are responsible for the development of LGMD1C, are also suspected of inducing a defect of membrane repair. We will examine the dysferlin-deficient 578 and the caveolin-3-deficient 650 cell lines that have been established from the vastus lateralis adult muscles of patients suffering from LGMD2B and LGMD1C, respectively. We will assess whether these cell lines are unable or not to repair membrane injuries. We will also analyze the behavior of Anx in these cells during and after cell membrane damage. This project aims at improving our understanding on the composition and the mechanism of the membrane repair machinery in human skeletal muscle and opening avenues for therapeutic applications.