Knock-in d'IDLV médié par MMEJ via CRISPR/Cas9 dans des cellules souches/progénitrices hématopoïétiques humaines

MMEJ-mediated IDLV knock-in via CRISPR/Cas9 in human hematopoietic stem/progenitor cells.

• Auteur / Autrice : Aboud Sakkal
• Direction : Anne Galy, Mario Amendola
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 04/12/2023
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Approches génétiques intégrées et nouvelles thérapies pour les maladies rares (Evry, Essonne)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université d'Évry Val d'Essonne
• Partenaire(s) de recherche : graduate school : Université Paris-Saclay. Graduate School Life Sciences and Health (2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Sylvain Fisson
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Els Verhoeyen, Claudio MUSSOLINO, Salima Hacein-Bey-Abina
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Els Verhoeyen, Claudio MUSSOLINO

Mots clés

Mots clés contrôlés

Réparation de l'ADN par jonction d'extrémités

Protéine-9 associée à CRISPR

Cellules souches

CRISPR-Cas9

Thérapie génique

Mots clés libres

Thérapie génique

Édition génétique

CRISPR-Cas9

Plateforme MMEJ

Lentivirus

Gene therapy

Gene editing

CRISPR-Cas9

MMEJ platform

Lentivirus

Résumé

La correction génique ex vivo des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) est apparue comme une approche thérapeutique prometteuse pour le traitement des troubles sanguins héréditaires chez l'homme.Les nouvelles technologies d'édition génétique permettant de cibler sélectivement l'ADN à l'aide de nucléases modifiées et d'insérer sur ce site spécifique une séquence génétique thérapeutique ont ouvert la porte à de nombreuses applications thérapeutiques. Plusieurs stratégies peuvent être utilisées pour insérer une séquence d'ADN à un site spécifique du génome.Les stratégies dépendant de la voie de réparation dirigée par l'homologie (HDR) nécessitent des constructions d'ADN avec de longs bras d'homologie qui pourraient dépasser la taille limite du vecteur utilisé comme fournisseur d'ADN et conduire à une intégration relativement faible. Atteindre le HDR dans les HSPC peut également conduire à une faible efficacité de prise de greffe, car le HDR nécessite une division cellulaire. Alternativement, la stratégie de jonction des extrémités médiée par la microhomologie (MMEJ) peut permettre l'insertion d'une matrice d'ADN avec moins d'homologie et présente de nombreux avantages par rapport au HDR en termes de taille du bras de microhomologie (MH) requis et de capacité à cibler les individus au repos et cellules en prolifération.Nous avons inventé une nouvelle plateforme appelée MiTiL (Microhomology meditated Target Integration using integrase-deficient lentiviral vector (IDLV).Ici, nous avons démontré l'efficacité et le faible profil de toxicité de notre plateforme MiTiL pour obtenir une intégration transgénique robuste dans plusieurs loci thérapeutiques et un site refuge dans les lignées cellulaires et les HSPC CD34+.À titre de preuve de concept, un gène rapporteur de la GFP et des gènes de la chaîne G commune du facteur VIII (FVIII) / récepteur de l'IL-2 (IL2RG) ont été ciblés sur un locus génétique cliniquement pertinent (HBA, IL2RG) ou un site refuge (AAVS1). ) en utilisant un vecteur viral IDLV et des complexes de ribonucléoprotéine (RNP) à guide unique ARN/Cas9. Nous démontrons des niveaux élevés d'édition stable du génome dans les lignées cellulaires K562, ED7R et dans les cellules primaires HSPC.En conclusion, nous avons réalisé une intégration efficace de transgènes spécifiques à un site dans les HSPC en utilisant une approche basée sur MMEJ pour l'addition ciblée de gènes. Cette plate-forme offre une alternative efficace à l'intégration transgénique basée sur le HDR pour le traitement des maladies humaines monogéniques affectant le système hématopoïétique, et nécessite donc des tests et un développement précliniques supplémentaires.

Ex vivo gene correction of hematopoietic stem and progenitor cells (HSPCs) has emerged as a promising therapeutic approach for the treatment of inherited human blood disorders.The new gene editing technologies for selectively targeting DNA using engineered nucleases and inserting at this specific site a therapeutic gene sequence has opened the door to many therapeutic applications. Several strategies can be used to insert a DNA sequence at a specific site in the genome.Strategies depending on the homology-directed repair (HDR) repair pathway requires DNA constructs with long homology arms that might exceed the cargo size limit of the vector used as DNA provider and lead to relatively low integration. Achieving HDR in HSPCs may also lead to low engraftment efficacy as HDR requires cell division. Alternatively, the Microhomology-mediated end joining (MMEJ) strategy can enable the insertion of a DNA template with less homology and has many advantages over the HDR in terms of the size of the required microhomology (MH) arm and the ability to target quiescent and proliferating cells.We invented a new platform called MiTiL (Microhomology meditated Target Integration using integrase-deficient lentiviral vector (IDLV).Here we demonstrated the efficiency and low toxicity profile of our MiTiL platform to achieve robust transgene integration in several therapeutic loci and safe harbor site in cell lines and CD34+ HSPCs.As a proof-of-concept, a GFP reporter gene and factor VIII (FVIII) / IL-2 Receptor common G-chain (IL2RG ) genes were targeted to a clinically relevant genetic locus (HBA, IL2RG) or safe harbor site (AAVS1) using IDLV virus vector and single guide RNA/Cas9 ribonucleoprotein (RNP) complexes. We demonstrate high levels of stable genome editing in K562, ED7R cell lines, and in HSPC primary cells.In conclusion, we have achieved efficient site-specific transgene integration in HSPCs utilizing a MMEJ-based approach to targeted gene addition. This platform provides an effective alternative to HDR-based transgene integration for the treatment of monogenic human diseases affecting the hematopoietic system, and so calls for additional pre-clinical testing and development.