Caractérisation des Cellules Souches Germinales humaines

par Clémentine Lapoujade

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Pierre Fouchet.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne ; 2015-....) , en partenariat avec Stabilité génétique, cellules souches et radiations (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-09-2018 .


  • Résumé

    Chez les patients traités par radiothérapie et/ou chimiothérapie (plus particulièrement chez les enfants atteints de cancer), un des effets secondaires majeurs qui altère la qualité de vie après guérison est l'atteinte du stock de cellules souches germinales (CSGs) et les problèmes d'infertilité qui en découlent. En effet, la spermatogenèse se développe à partir de ces CSGs dés la puberté pour aboutir à la production de spermatozoïdes dans le testicule. Des lésions génétiques ou épigénétiques peuvent également être générées dans les CSGs exposées aux radiations ionisantes et être ainsi transmises aux descendants, pouvant conduire à un risque héréditaire permanent. Après traitement d'un cancer dans l'enfance, 1 homme sur 3 présentera des troubles irréversibles de fertilité. Le développement de nouvelles technologies en reproduction humaine est nécessaire afin d'apporter des solutions curatives à ces troubles de la fertilité. Les jeunes patients pubères ainsi que les hommes adultes peuvent bénéficier d'une préservation de fertilité grâce à l'autoconservation de spermatozoïdes. Ceci n'est évidemment pas possible chez l'enfant prépubère qui n'a pas initié sa spermatogénèse, et la préservation de biopsies testiculaires avant le début des traitements anticancéreux est actuellement préconisée chez ces patients dans l'optique du développement de nouvelles thérapies. Des travaux récents de transplantation de CSGs chez le macaque Rhésus ont permis de restaurer, chez l'animal stérilisé, une spermatogénèse permettant la fécondation in vitro d'ovocytes par micro-injection intracytoplasmique de spermatozoïde. Ces résultats très encourageants font entrer pour la première fois la transplantation des CSGs dans le champ de l'application préclinique. L'utilisation des CSGs en thérapie cellulaire constitue donc un objectif essentiel pour le traitement de l'infertilité chez l'homme consécutive aux traitements anticancéreux. Cependant, l'identité du pool de CSGs humaines et les mécanismes moléculaires gouvernant leur autorenouvellement restent peu connus. Ce projet de thèse vise à caractériser les CSGs humaines, afin d'évaluer leur potentiel de régénération. L'étude des mécanismes moléculaires régulant la physiologie des CSGs devrait contribuer à développer des conditions de culture soutenant l'expansion in vitro de ces cellules, qui est une étape clé pour leur utilisation potentielle en thérapie cellulaire. Il est également important dans cette optique d'étudier les effets de l'irradiation sur les GSGs et le microenvironnement testiculaire, qui régule leur destin cellulaire, afin d'améliorer et de minimiser les effets secondaires des thérapies/conditionnements utilisés (irradiation/chimiothérapie). Ce projet est réalisé en collaboration étroite avec le service hospitalier du Pr Wolf (CECOS Cochin-APHP et Unité Inserm 1016) qui collecte le tissu testiculaire et conserve les cellules germinales. Nous travaillons sur des biopsies de patients adultes (Agrément CPP Ile de France IV-Protocole GERMPLAST 2012/40NICB) et depuis récemment sur des biopsies de patients prépubères (Agrément CPP Sudest2- Protocole GERMCELL 2016-A01824-47). Nous avons ainsi défini par cytométrie en flux une population cellulaire enrichie en CSGs et contenant les progéniteurs spermatogoniaux les plus immatures, à l'aide de différents marqueurs (Side Population-SP, al-6 intégrine, Thy-1, et ß-2 microglobuline). Pour l'étude fonctionnelle des CSGs humaines, nous avons développé un test in vivo de fonctionnalité après transplantation dans les testicules de souris immunodéficientes 'humanisées' NSG, permettant d'observer un début de colonisation des tubules séminifères murins par les CSGs humaines. D'autre part, différentes conditions de culture ont été testées in vitro et permettent la culture des cellules souches/spermatogonies immatures sur une période de 21 jours. Ces deux tests de fonctionnalité ont montré que les CSGs adultes étaient présentes et hautement enrichies dans la sous-population cellulaire SPal6+Thy-1+ß-2M-. Enfin, nous avons tiré profit de la méthode d'analyse et de purification des différentes sous-populations germinales afin d'établir un transcriptome (collaboration Plateforme Genomic, Institut Cochin), permettant d'étudier les variations d'expression du génome au cours de la spermatogenèse humaine chez l'individu adulte. Nous avons ainsi pu définir un profil d'expression spécifique pour la fraction SPal6+Thy-1+ß-2M- hautement enrichie en CSGs (manuscrit en préparation), et identifier notamment un réseau de facteurs de transcription préférentiellement exprimé dans cette population. Ce projet de thèse, qui s'inscrit dans la continuité des travaux précédemment décrits, comporte deux parties et sera réalisé en collaboration avec l'équipe du Pr Wolf (BDR-CECOS Cochin-APHP et Unité Inserm 1016): - (1) il tend tout d'abord à comprendre les mécanismes moléculaires sous-jacents à l'autorenouvellement des CSGs. Pour cela, nous exploiterons les résultats du transcriptome que nous avons réalisé. Dans un premier temps, nous nous focaliserons sur les facteurs de transcription les plus exprimés dans la population SPal6+Thy-1+ß-2M-, notamment le facteurs MLLT3. Ce travail sera réalisé en parallèle sur les modèles murin et humain de CSGs, que nous avons développés au laboratoire. Nous déterminerons si l'expression des gènes identifiés chez l'humain est conservée dans la population de CSGs de souris. Le rôle de ces différents gènes sera étudié in vitro après inhibition par RNAi des gènes candidats dans les CSGs (siRNA, vecteurs lentiviraux shRNA). La fonctionnalité et l'amplification du nombre des CSGs seront testées in vitro en culture et in vivo après transplantation dans des testicules de souris stériles. L'impact de la modulation de l'expression de ces gènes sur la quiescence, le cycle cellulaire et l'autorenouvellement/entrée en différentiation des CSGs sera étudié. - (2) nous proposons en parallèle de développer des outils expérimentaux d'étude des GSGs humaines : (i) création in vitro d'un système de culture des CSGs humaines à long terme afin de les amplifier (ii) création d'un modèle de xénogreffe de tissu testiculaire humain dans des testicules de souris immunodéficientes, afin d'élaborer un modèle d'étude in vivo. Le développement de ces outils devrait permettre à terme d'étudier l'effet des traitements anticancéreux (radiothérapie/chimiothérapie) sur l'intégrité génétique et fonctionnelle des CSGs, ainsi que sur la fonctionnalité du microenvironnement testiculaire.

  • Titre traduit

    Human germinal stem cell characterization


  • Résumé

    In patients treated with radiotherapy and/or chemotherapy (particularly in children with cancer), one of the major side effects that affects the quality of life after healing is the attrition of the germline stem cell pool (GSCs) and the subsequent problems of infertility. Indeed, spermatogenesis develops from these GSCs, at the onset of puberty, to result in the production of sperm in the testis. Genetic or epigenetic lesions can also be generated in CSGs exposed to ionizing radiation and thus be transmitted to the offspring, which may lead to a permanent hereditary risk. After treating cancer in childhood, 1 in 3 men will have irreversible fertility issues. The development of new technologies in human reproduction is necessary in order to provide curative solutions to these fertility disorders. Young pubescent patients as well as adult men can benefit from fertility preservation through the self-preservation of spermatozoa. This is obviously not possible in prepubertal children who have not initiated their spermatogenesis, and the preservation of testicular biopsies before the start of cancer treatments is currently recommended in these patients in view of the development of new therapies. Recently in non-human primates model, testicular transplantation of donor GSCs in a recipient sterilized animal revealed to be successful to restore spermatogenesis and to produce donor-derived sperm allowing in vitro fertilization of oocytes by intracytoplasmic microinjection. These very encouraging results bring CSG transplantation into the field of clinical application for the first time, and the development of banking germline stem cells from patients at risk of infertility due to anticancer therapy. However, the identity of the pool of human CSGs and the molecular mechanisms governing their self-renewal remain poorly known. This thesis project aims to characterize human CSGs, in order to evaluate their regenerative potential. The study of the molecular mechanisms regulating the physiology of CSGs should contribute to the development of culture conditions supporting the in vitro expansion of these cells, which is a key step for their potential use in cell therapy. It is also important in this context to study the effects of irradiation on GSGs and the testicular microenvironment, which regulates their cell fate, in order to improve and minimize the side effects of the therapies / conditioning used (irradiation / chemotherapy). This project is performed in close collaboration with the hospital department of Professor Wolf (CECOS Cochin-APHP and Inserm Unit 1016) which collects the testicular tissue. We are working on biopsies of adult patients (CPP Ile de France IV-Protocol GERMPLAST 2012 / 40NICB) and on biopsies of prepubertal patients (CPP Sudest2-Protocol GERMCELL 2016-A01824-47). We thus defined by flow cytometry a cell population enriched in GSCs and containing the most immature spermatogonial progenitors, using different markers (Side Population-SP, al-6 integrin, Thy-1, and ß-2 microglobulin ). For the functional study of human CSGs, we have developed an in vivo test of functionality after transplantation in the testis of NSG 'humanized' immunodeficient mice, allowing to observe an early colonization of murine seminiferous tubules by human CSGs. On the other hand, different culture conditions have been tested in vitro and allow the culture of immature stem cells / spermatogonia over a period of 21 days. These two functionality tests showed that adult CSGs were present and highly enriched in the SPal6 + Thy-1 + ß-2M- cell subpopulation. Finally, we took advantage of the method of analysis and purification of the different germ subpopulations to establish a transcriptome (collaboration platform Genomic, Cochin Institute), to study the variations of expression of the genome during human spermatogenesis in the adult individual. We have thus been able to define a specific expression profile for the SPal6 + Thy-1 + ß-2M- fraction highly enriched in CSGs (manuscript in preparation), and in particular to identify a network of transcription factors preferentially expressed in this population. This thesis project, which is a continuation of the previously described work, has two parts and will be carried out in collaboration with the team of Pr Wolf (BDR-CECOS Cochin-APHP and Inserm Unit 1016): - (1) first it aims to understand the molecular mechanisms underlying the self-renewal of GSCs. This will be based on the results of the transcriptome that we realized. First, we will focus on the most expressed transcription factors in the SPal6 + Thy-1 + ß-2M- population, including the MLLT3/AF9 factor. This work will be done in parallel on the mouse and human models of GSGs, that we have developed in the laboratory. We will determine whether the expression of genes identified in humans is conserved in the mouse CSGs population. The role of these different genes will be studied in vitro after RNAi inhibition of candidate genes in GSCs (siRNA, lentiviral shRNA vectors). The functionality and amplification of the number of GSCs will be tested in vitro in culture and in vivo after transplantation into sterile mouse testes. The impact of the modulation of the expression of these genes on the quiescence, the cell cycle and the self-renewal / entry into differentiation of the CSGs will be studied. - (2) we propose in parallel the development of experimental tools for the study of human GSCs: (i) in vitro creation of a long-term human CSG culture system in order to amplify them (ii) creation of a model of human testicular tissue xenograft in immunodeficient mouse testes, in order to develop an in vivo study model. The development of these tools should eventually allow to study the effect of anticancer treatments (radiotherapy / chemotherapy) on the genetic and functional integrity of CSGs, as well as on the functionality of the testicular microenvironment.