Interrogation par optogénétique de la propagation des signaux mécaniques dans les tissus biologiques.

par Adrien MÉRy

Projet de thèse en Physique pour les Sciences du Vivant

Sous la direction de Thomas Boudou et de Martial Balland.

Thèses en préparation à Grenoble Alpes , dans le cadre de École doctorale physique (Grenoble) , en partenariat avec Laboratoire Interdisciplinaire de Physique (laboratoire) et de MOTIV : Matériaux, Optique et techniques instrumentales pour le vivant (equipe de recherche) depuis le 01-10-2018 .


  • Résumé

    La transmission de signaux mécaniques et biochimiques est un paramètre critique de la coordination spatio-temporelle des réarrangements structurels multi-échelle au cours de la formation d'organismes (embryogenèse), de tissus ou d'organes (morphogenèse). A l'échelle cellulaire, les communications cellule-cellule régulent les processus d'organisation tels la formation de vaisseaux par exemple (1), tandis que la transmission de forces sur de longues distances guide les réorganisations architecturales à grande échelle, telles que la formation et la régénération des organes (2). Bien que les signaux mécaniques aient été mis en évidence comme des régulateurs des processus de mitose, de migration ou de différenciation (3), les mécanismes responsables de la signalisation mécanique multi-échelle dans les tissus restent aujourd'hui très mal connus. Depuis les années 1990, les structures moléculaires de génération et de transduction des forces cellulaires ont été largement étudiées. Le cytosquelette, un réseau dynamique composé notamment d'actine, actionné par des moteurs moléculaires (e.g. myosines) est la structure fondamentale de génération et de transmission des forces (4). Schématiquement, le cytosquelette applique et transmet des forces de l'intérieur (noyau, cytoplasme) vers l'extérieur (matrice extra-cellulaire, cellules voisines). Afin d'étudier la transmission des forces dans un tissu, il faudrait donc pouvoir simultanément moduler et mesurer les forces cellulaires, tout en évaluant précisément l'organisation du cytosquelette et l'architecture de la matrice extra-cellulaire (MEC). Plusieurs approches ont été développées pour mesurer les forces cellulaires (5,6) mais il n'existe actuellement aucune méthode pour moduler localement et dynamiquement les forces cellulaires. En effet, les approches classiques (pharmacologie, génétique) ne permettent pas le contrôle spatio-temporel des forces à l'échelle de la cellule unique. La découverte récente de l'optogénétique, impliquant l'utilisation de la lumière pour moduler des processus cellulaires dans des tissus vivants, a été utilisée notamment pour contrôler la signalisation de cellules neuronales ou musculaires (7,8). Mais cette technique pourrait aussi être appliquée à la modulation locale de régulateurs clés de l'activité de la myosine, ouvrant ainsi la voie pour moduler les forces cellulaires 'de l'intérieur' avec un contrôle spatio-temporel sans précédent. En combinant ingénierie de microtissus, optogénétique et physique théorique, cette thèse vise à identifier les échelles caractéristiques de propagation spatiale et de persistance temporelle des forces cellulaires dans des assemblages multicellulaires 3D modèles. L'ingénierie tissulaire implique la formation de microtissus 3D, composés de cellules fibroblastes et d'une matrice de collagène, dans un microsystème (Fig. 1.A-B). Ce microsystème permet de d'évaluer à la fois l'architecture microscopique du cytosquelette et du collagène, ainsi que les forces cellulaires (9,10);. L'optogénétique a récemment émergé comme un moyen de contrôler l'activité spatio-temporelle des signaux biochimiques cellulaires grâce à la lumière (11). L'objectif ici consiste à moduler localement l'activité contractile de fibroblastes (Fig. 1.C-D). Au cours de son stage de Master 2, le candidat a déjà démontré la possibilité de moduler, par stimulation lumineuse, l'activité d'ArhGEF11 (régulateur majeur de la contractilité cellulaire) (12 de fibroblastes constituant un microtissu 3D (Fig. 1.E-F). Il a ainsi caractérisé la réponse contractile de tissu 3D en fonction de l'énergie lumineuse de stimulation ainsi que du nombre de cellules stimulées. La combinaison des systèmes d'optogénétique et d'ingénierie tissulaire étant à présent fonctionnelle et caractérisée, il est maintenant possible d'étudier comment une perturbation locale de l'équilibre mécanique se propage dans un tissu 3D. La première année de thèse sera donc consacrée à déterminer expérimentalement les distances et temps caractéristiques de propagation d'un signal mécanique en fonction de la taille et de l'intensité de ce signal. Pour cela, la taille et l'intensité de la stimulation lumineuse seront variées de manière systématique, tandis que les champs de déplacements et de déformations seront quantifiés par vélocimétrie par image de particules (PIV). La force et la contrainte globale seront aussi déduites des mesures de flexion des micropiliers flexibles soutenant le microtissu. Au cours de la seconde année de thèse, le doctorant travaillera à discriminer les rôles respectifs des différents paramètres du système. Pour cela, la constante de raideur des micropiliers (i.e. les conditions aux limites), les propriétés mécaniques du collagène (densité et taille des fibres) et la densité de cellules photosensibles seront variées systématiquement. Ces trois paramètres ont précédemment été démontrés comme primordiaux dans la réponse mécanique globale d'un microtissu mais leur impact sur la propagation d'un signal mécanique dans un environnement multicellulaire 3D reste inconnu. La réponse biologique du système sera finalement évaluée durant la troisième année de thèse. En effet, ArhGEF11 étant un régulateur clé de la tension du cytosquelette, les changements de quantité et d'organisation de l'actine fibrillaire dans les cellules stimulées et leurs voisines seront évalués par immunofluorescence quantitative. De même, comme les adhésions cellule/cellule (principalement médiées par les cadhérines) et cellule/MEC (principalement médiées par les intégrines) sont finement régulées par les forces cellulaires (5,13,14), leur formation et taille seront simultanément évaluées par immuno-marquage de la vinculine et de la N-cadhérine, deux protéines impliquées dans la transmission et la régulation des forces cellulaires à la membrane (14,15). Des données récentes suggèrent que la nature fibreuse du collagène, est essentielle à la transmission des forces sur des distances faisant 10 à 20 fois le diamètre d'une cellule (16,17). Le remodelage local et distal du collagène entraîné par la photo-activation de la contractilité sera évalué par microscopie de 2nde harmonique en collaboration avec A. Gourier (LIPhy) et par immunofluorescence quantitative. Parallèlement à ce travail expérimental, et en collaboration avec le Pr. Ulrich Schwartz (physicien théoricien, U. Heidelberg), le doctorant développera un cadre théorique afin de modéliser et prédire la propagation de signaux mécaniques au sein d'un tissu. Cette théorie, actuellement en cours de réflexion, sera probablement basée sur un modèle à trois éléments, dans lequel la rigidité cellulaire (incluant la rigidité des cellules et des contacts cellules-cellules) est modélisée par une équation constitutive hyperélastique, en série avec un élément contractile actif obéissant à une relation contrainte/déformation de type Hill (modélisant la contraction des moteurs moléculaires, i.e. myosine). Ces 2 composantes agissent en parallèle avec la matrice de collagène, dont le comportement est considéré comme hyperélastique non-linéaire. Les résultats de ce projet contribueront donc à approfondir notre compréhension des mécanismes physiques de transmission des forces à longue distance dans les tissus biologiques, qui sont d'un intérêt majeur en physiologie et en physiopathologie.

  • Titre traduit

    Optogenetic interrogation of the propagation of mechanical signals in biological tissues.


  • Résumé

    The transmission of mechanical information are key to the spatio-temporal coordination of multi-scale architectural rearrangements during embryo- or morphogenesis. At the level of single cells, cell-cell communication regulates patterning such as tube formation (1), while long-range force transmission can mediate large-scale architectural rearrangements such as the formation and regeneration of organs (2). Although we have some clues to how mechanical signals regulate mitosis, migration or differentiation (3), the mechanisms behind the multi-scale, mechanical signalization in tissues, such as the characteristic length-scales of spatial propagation and temporal persistence of the signal, remains mostly unknown. Since the 1990's, the structural bases of force generation and transduction in cells have been widely studied. The cytoskeleton, a highly dynamic scaffold of actin, microtubules and intermediate filaments actuated by molecular motors, is a fundamental structure for mediating force transmission (4). Schematically, the cytoskeleton connects and apply forces between the cell inside (nucleus and cytoplasm), and the outside (extracellular matrix and neighboring cells). In order to investigate the spatio-temporal propagation of mechanical signals throughout a tissue, one would therefore need to simultaneously modulate and measure cell-generated forces, while evaluating fine-scale cytoskeletal and extracellular architecture. While several approaches have been developed for measuring cell forces (5,6), there is currently no methods for locally varying the signaling pathways responsible of cell forces, since pharmacological or genetic approaches cannot be used locally, at the single cell level. Recently, the advent of optogenetics, which involves the use of light to control cells in living tissue (7,8), could pave the way to locally actuate key regulators of the molecular motor myosin II, thus opening an elegant avenue for controlling cell-generated forces “from the inside”. By combining tissue engineering, optogenetics and theoretical physics, this PhD aims at identifying the characteristic length-scales of spatial propagation and temporal persistence of mechanical signals in 3D, multicellular assembly. The tissue engineering approach implies the formation of 3D microtissues, made of fibroblast cells and collagen matrix in a microsystem (Fig. 1.A-B). This microsystem allows to measure both fine-scale cytoskeletal and extracellular architecture, as well as cell-generated forces(9,10). Optogenetics recently emerged as a way to control the spatio-temporal activity of cellular biochemical cues with light (11). Here the objective consists in spatio-temporally modulating cell physiological contractile activity (Fig. 1.C-D). During his Master 2 internship, the candidate already demonstrated the possibility to modulate, using light, the activity of ArhGEF11 (major regulator of cell contractility) in fibroblast cell constituting a 3D microtissue (Fig. 1.E-F). He characterized the contractile response of these 3D microtissues in function of the light intensity and the cell density. As the combination of optogenetics and tissue engineering is now working and characterized, it is now possible to study how a local perturbation of the mechanical equilibrium propagates throughout a 3D tissue. The first year of the PhD will be dedicated to experimentally determine the characteristic length-scales of spatial propagation and temporal persistence of mechanical signals in 3D, multicellular assembly, depending on the size and intensity of this signal. To this end, the size and intensity of the light stimulation will be systematically varied, while the resulting field of displacement and deformation will be quantified by particle image velocimetry (PIV). The global force and stress will also be assessed by measuring the deflection of the flexible micropillars that constrain the microtissue. During the second year, the PhD student will work at discriminating the respective roles of the different parameters of the system. The spring constant of the micropillars (i.e. boundary conditions), the mechanical properties of the collagen (density and size of the fibers), and the cell density will be systematically varied. These three parameters have been previously shown as key to the global mechanical response of a microtissue but their impact on the propagation of a mechanical signal in a 3D, multicellular environment is still unknown. The biological response of the system will finally be assessed during the third year of the PhD. As ArhGEF11 is a key regulator of the cytoskeletal tension, the changes in amounts and organization of fibrillary actin in stimulated cells will be assessed using quantitative immunofluorescence. Similarly, as focal adhesions and cell-cell junctions are finely regulated by cytoskeletal forces (5,13,14), their formation and size will be concurrently evaluated by immuno-staining vinculin and N-cadherin, two membrane-cytoskeletal proteins involved in the “outside-in” force transmission and regulation (14,15). As recent evidence suggests that the fibrillary nature of the collagen is critical for transmission of force over scales that are 10–20 times the diameters of the cells (16,17), the local and distant colalgen reorganization and remodeling upon local contractility activation will be assessed by immuno-staining before confocal imaging and by 2nd harmonic generation (SHG) microscopy in collaboration with A. Gourier (LIPhy). Complementary to this experimental approach, and in collaboration with Pr. Ulrich Schwartz (theoretical physicist, U. Heidelberg), the PhD student will develop a theoretical framework to model and predict the propagation of mechanical signals in 3D tissues. This theory,currently debated, will probably be based on a three-element model where tissue stiffness, including cell stiffness and cell–cell contact stiffness, are modeled using a hyperelastic constitutive relation in series with an active contractile element that obeys a Hill-like stress vs. strain-rate relation. These components act in parallel with the collagen matrix, whose mechanical behavior is considered as non-linear hyperelastic. Overall, the results of this PhD will contribute to further our understanding of the physical mechanisms regulating long-range force transmission in biological tissues, which have key relevance in physiology as well as pathophysiology.