Etude des rôles de RNase H aux fourches de réplication

par Samira Kemiha

Projet de thèse en Biologie Santé

Sous la direction de Armelle Lengronne et de Jérôme Poli.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....) , en partenariat avec IGH - Institut de Génétique Humaine (laboratoire) et de Maintien de l'intégrité du génome au cours de la réplication (equipe de recherche) depuis le 31-08-2018 .


  • Résumé

    La réplication de l'ADN est initiée en de multiples sites chez les eucaryotes et réalisée par un complexe multiprotéique appelé « réplisome ». Les réplisomes en progression forment des fourches de réplication, qui sont fréquemment stoppées par divers obstacles (dommages de l'ADN, complexes ADN-protéine ou complexe ADN-ARN,…) présents sur la matrice à dupliquer. Les fourches de réplication arrêtées sont des structures fragiles qui, si elles persistent, génèrent de l'instabilité génétique. Par l'ajout d'agents génotoxiques ou bien en imposant un arrêt forcé des fourches par un complexe protéique, il est possible d'augmenter la fréquence des blocages ou de ralentir la progression des fourches de réplication, ce qui se traduit par une situation de stress réplicatif. Dans ces conditions, les cellules eucaryotes sont capables de réparer et/ou redémarrer des fourches arrêtées, par des mécanismes qui en grande partie restent à découvrir. Le laboratoire du Dr Philippe Pasero au sein duquel sera réalisé le projet étudie ces mécanismes dans différents contextes biologiques. Le projet de thèse se porte sur l'étude de la potentielle implication des enzymes Rnases H dans le processing des fourches de réplication au cours d'un stress réplicatif. Les enzymes Rnases H sont conservées au cours de l'évolution, on les retrouve aussi bien chez les bactéries que chez l'homme. Chez l'homme, les mutations des gènes codant pour cette enzyme sont la cause d'une pathologie auto-inflammatoire appelée le syndrôme d'Aicardi- Goutières (AGS). Ces enzymes sont capables (i) de cliver les ribonucléotides monophosphates (rNMPs) incorporés dans l'ADN génomique, (ii) participent à la maturation des fragments d'Okazaki en dégradant l'amorce ARN et (iii) de dissocier les hybrides ADN/ARN présents dans le génome. Bien que ces fonctions ont été caractérisées, la contribution de chacune des fonctions au maintien de l'intégrité du génome reste obscure. A l'aide de deux modèles : levures et cellules humaines, notre but est de comprendre quels aspects des fonctions des enzymes Rnases H sont indispensables pour la réplication de l'ADN. Chez la levure S. cerevisiae, les mutants sont sensibles à des expositions prolongées à des agents induisant un stress réplicatif (Hydroxurée/HU, MMS). Malgré cette sensibilité, les mutants sont capables de continuer à se répliquer à la suite d'un traitement aigu mais restent bloqués en G2/M. Grâce à des techniques de ChIP-qPCR, nous avons observé un défaut d'enrichissement RPA à différentes fourches de réplication arrêtées, ce qui suggeste un défaut de processing de l'ADN néo-naissant. Avec la technique des fibres d'ADN dans des cellules HeLa déplétées en Rnase H2B, nous avons observé un défaut de résection à des fourches de réplication arrêtées (HU) et à des cassures double brin (Bleocin). De plus, ces cellules présentent un défaut de prolifération, forment des micro-noyaux et accumulent de l'ADN simple brin cytosolique. L'ensemble de ces résultats suggèrent un rôle critique des enzymes Rnases H dans le maintien de l'intégrité du génome et plus précisément dans le processing des fourches de réplication arrêtées au cours d'un stress réplicatif. En utilisant des mutants de séparation de fonctions, nous investiguons actuellement l'origine de ces phénotypes.

  • Titre traduit

    Investigating the roles of RNase H at the replication forks


  • Résumé

    DNA replication is initiated at specific sites on the DNA, which are called origins of replication and is realized by a multiproteic complex, the replisome. Replisomes form replication forks, which frequently stall when they encounter obstacles on the parental DNA such as DNA lesions, secondary DNA structures or tightly bound protein complexes. Stalled replication forks are fragile structures which can lead to genomic instability if they are not rapidly restarted. By adding genotoxic agents or by using site specific replication fork barrier, fork stalling frequency can be increased and leads to replication stress. In this context, eukaryotic cells have developed mechanisms to repair and restart stalled forks which are not fully understood. The laboratory of Dr Philippe Pasero where the project will be realized studies these mechanism in different biological contexts. The thesis project is based on the study of the potentiel implication of the Rnase H enzymes in the processing of stalled replication forks during a replication stress. Rnase H enzymes are conserved from bacteria to men, which cause an inflammation-based pathology called Aicardi-Goutières syndrome (AGS) if mutated. They share a ribonuclease activity which removes (i) ribonucleotide monophosphates (rNMPs) in the genome, (ii) RNA primers during Okazaki fragments maturation and (iii) dissociates RNA/DNA hybrids genome-wide. Although all these functions have been characterized, their relative contribution to the maintenance of genome integrity is still unclear. Using yeast and human cells, we aim at understanding which aspects of RNase H functions are crucial for DNA replication. RNase H mutants in S.cerevisiae are sensitive to prolonged exposure to replication stress-inducing agents (hydroxyurea/HU, MMS). Despite this sensitivity, they are able to proficiently resume replication after an acute treatment but accumulate in G2/M. Using ChIP-qPCR, we observed a defect in RPA loading at stalled replication forks, which suggests nascent DNA processing defect. Using DNA fiber spreading in RNase H-depleted HeLa cells, we observed a DNA resection defect at stalled replication forks (HU) and at Double-Strand Breaks (Bleocin). Moreover, RNase H-depleted human cells exhibit a proliferation defect, form micronuclei and accumulate cytosolic ssDNA. Altogether, these data suggest a critical role of RNase H in genomic stability and more precisely in the processing of stalled replication forks. Using separation of functions mutants, we are currently investigating the origin of these phenotypes.