Interaction neurone-glie: implication de la glie dans le maintien de l'homéostasie du milieu extracellulaire dans des conditions physiologiques et pathologiques.

par Xia Li

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Micaela Galante.

Thèses en préparation à université Paris-Saclay , dans le cadre de École doctorale Signalisations et réseaux intégratifs en biologie , en partenariat avec Institut des Neurosciences Paris-Saclay (laboratoire) et de Faculté de médecine (référent) depuis le 30-09-2018 .


  • Résumé

    L'ischémie cérébrale est caractérisée par une interruption totale ou partielle de l'apport sanguine au cerveau, conduisant à une privation d'oxygène et de glucose pour les cellules du cerveau. La série de processus cellulaires qui sont déclenchées par une ischémie cérébrale sont nombreux et complexes. La réduction sévère d'oxygène et de glucose induit la diminution de la production d'ATP et un changement drastique de la concentration de K+, du pH intracellulaire et extracellulaire et de la production de lactate. La perturbation du métabolisme énergétique au sein des tissus ischémiés conduit rapidement à la dépolarisation membranaire et à une altération de l'homéostasie du milieu extracellulaire qui conduit, in fine, à la formation d'un œdème cérébral. Bien que de nombreux traitements pour pallier les effets de l'ischémie cérébrale aient été proposés, peu se révèlent efficaces à cause d'un manque de spécificité des outils pharmacologiques et/ou en raison de leurs effets secondaires délétères. Dans ce contexte, un traitement par hypothermie modérée représente une approche intéressante, qui aurait peu d'effets collatéraux. Dans la première partie de PhD, j'ai étudié l'ischémie cérébelleuse en analysant les effets de la température sur la réponse de la glie de Bergmann (BG). La BG est un type de glie radiaire du cortex cérébelleux et un travail récent du laboratoire a montré qu'elle répond à une privation d'oxygène et de glucose (Oxygen and glucose deprivation, OGD) par une dépolarisation de membrane et une augmentation importante de la concentration de Ca2+ cytosolique. On a alors mené des expériences d'OGD dans deux conditions : à des températures proches de la température physiologique (31°-33°C) et à des températures plus basses (21°-23°C). Par des approches d'électrophysiologie (patch-clamp et microélectrodes sensibles au K+), on a montré que baisser la température du milieu extracellulaire induit un retard dans la réponse de la BG à l'OGD. En particulier, la dépolarisation de la membrane qui est due à une augmentation [K+]e, présente une cinétique qui est environ 2 fois plus lente qu'en conditions plus physiologiques. De plus, pour étudier les mécanismes à la base de la formation de l'œdème, nous avons d'une part quantifié le gonflement généralisé du tissu cérébelleux et de l'autre le changement de volume de la BG, ceci par microscopie confocale. Les résultats indiquent qu'au cours de l'OGD l'ensemble de la couche moléculaire du cervelet gonfle dramatiquement. Par contre, pendant l'OGD, le changement morphologique de BG dépend de ses différentes parties: le corps cellulaire de BG rétrécissent, alors que la glia limitans gonflent. Et encore une fois, une baisse de température ralentit le changement morphologique de BG. Ces résultats montrent que, lors d'un épisode ischémique dans le cervelet, la température basse réduit les effets délétères et ralentit la cinétique de l'homéostasie potassique et hydrique, un processus de régulation auquel la BG semble bien participer. Après avoir rejoint la nouvelle équipe de Glenn Dallérac, je continue à étudier l'interaction-neuroglie mais en relation avec le projet principal de l'équipe visant à comprendre le rôle des astrocytes dans la modulation dopaminergique de l'activité du cortex préfrontal. Cette région cérébrale est importante pour intégrer des différentes informations et est donc essentielle pour les fonctions cognitives, y compris la prise de décision, la planification et la mémoire de travail, etc. Le cortex préfrontal est soumis à de fortes neuromodulations monoaminergiques, notamment par la dopamine issue du VTA. Ceci est mis en évidence par des maladies comme la schizophrénie ou la maladie de Parkinson qui ont des troubles de l'homéostasie dopaminergique dans la cortex préfrontal. Il est donc important d'étudier la modulation dopaminergique de l'activité du cortex préfrontal. Dans un première part, par des approches d'électrophysiologie et de la pharmacologie, on a étudié la voie de signalisation de la modulation de la D-sérine – coagoniste de récepteur NMDA – par dopamine. Dans cet étude, on a montré que la cascade de signalisation AC-cAMP-PKA est la voie clé pour la modulation dopaminergique de la fonction de D-sérine. Cette étude a montré une intéraction entre le récepteur de dopamine et le récepteur NMDA, ce qui peut fournir un nouvel aperçu des deux hypothèses proposées pour schizophrénie dont l'hypothèse de dérégulation glutamatergique et l'hypothèse de dérégulation dopaminergique. Comme la D-sérine est considérée comme un gliotransmetteur libérée par des cellules gliales, et que la D-sérine est régulé par la dopamine, il est donc aussi important de travailler sur les modulations dopaminergiques par des astrocytes dans les cortex préfrontal. Et ceci est le projet sur lequel je travaille actuellement. Une question principale du projet est si les astrocytes peuvent libérer la dopamine et contrôler l'activité neuronale dans le cortex préfrontal. Pour répondre à cette question, j'ai utilisé le technique de patch-clamp pour voir l'effet de la dopamine astrocytaire sur l'activité des neurones pyramidaux à côté. Selon les résultats, la dopamine diffusée dans le réseau astrocytaire peut diminuer l'excitabilité des neurones, ceci est montré par une diminution de la fréquence instantanée de décharge des neurones pyramidaux après 30 minutes de dialyse de l'astrocyte avec dopamine (25µM). Ensuite, j'ai aussi regardé le potentiel post-synaptique excitateur (PPSE) de champs pendant que je charge l'astrocyte avec dopamine (25µM). Selon le résultat, ils indiquent que la dopamine astrocytaire augmente la transmission synaptique au niveau post-synaptique. Ces effets de la dopamine observés dépendent du réseau astrocytaire (montré par souris connexine 30 and 43 double knock-out) et sont médiés par la transporteur vésiculaire de monoamine de type 2 (VMAT2) astrocytaire (montré par souris astro-VMAT2 knock-out). En plus, pour voir la diffusion de dopamine dans le réseau astrocytaire et la libération de dopamine par des astrocytes, on a fait des expériences d'imageries. Deux approches sont utilisées : 1, Fluorescent False Neurotransmitter 202, FFN202 : En utilisant ces sondes fluorescentes(ex 370nm/em 458nm), qui changent la fluorescence pendant la libération à l'espace extracellulaire, on a vu la diffusion dans le réseau astrocytaire. Cependant, on a pour l'instant accès à un laser 405nm qui n'est pas optimal pour exciter le FFN202, ce qui nous a empêché à bien visualisé la libération de FFN202 dans le cortex préfrontal. Pour l'amélioration de la visualisation de FFN202, on doit donc refaire l'expérience à l'aide d'un microscope à 2 photons qui va nous permettre d'exciter FFN202 à la longueur d'onde optimale. 2, G-protein-coupled receptor-activation-based DA, GRABDA : Ceci est une sonde fluorescente récemment conçue pour détecter la libération de DA. Ces sondes sont des récepteurs dopaminergiques modifiés qui peuvent émettre une fluorescence lors de la liaison de la dopamine. En plus, ces sondes sont très sensibles à la dopamine extracellulaire. Nous avons déjà réalisé une stéréotaxie pour injecter le virus portant de la construction GRABDA dans le cortex préfrontal. L'idée est d'infecter les cellules du PFC, puis de stimuler spécifiquement les astrocytes pour observer le schéma de libération de la dopamine. Avec les stimulations astrocytaire, nous espérons à détecter la libération de dopamine par les astrocytes en détectant le changement de fluorescence de GRABDA. Avec ces approches, on peut caractériser la diffusion et la libération de dopamine dans le réseau astrocytaire non seulement dans les souris sauvage, mais aussi dans des souris transgéniques pour étudier le mécanisme impliqué. Ces résultats montrent que la dopamine astrogliale peut moduler l'activité neuronale et synaptique, en plus les astrocytes peuvent réguler l'homéostasie de la dopamine extracellulaire, on suppose que les astrocytes pourraient représenter une nouvelle cible thérapeutique pour les maladies associées à l'hypodopaminergie comme la schizophrénie (SCZ). J'ai donc cherché à caractériser les déficits physiologiques et comportementaux dans un modèle souris de SCZ pour tester si ces déficiences peuvent être atténuées par l'administration virale de tyrosine hydroxylase (TH) dans les astrocytes du cortex préfrontal. Dans un première temps, on a utilisé un modèle souris de SCZ qui est induit par l'isolation sociale de 1-2 mois après le sevrage. Par des approches d'électrophysiologie dans le cortex préfrontal, on a trouvé que dans le groupe isolé, il y a une augmentation significative de la réponse synaptique par rapport au groupe wild-type. Pourtant, l'induction de la potentialisation à longue terme n'est pas altérée dans ces souris isolées. Ce qui est maintenant nécessaire pour cette partie du projet est caractériser davantage les modifications de la transmission synaptique par des enregistrements intracellulaires pour le courant excitateur et inhibiteur. Pour mieux comprendre le changement hypodopaminergique de ces souris schizophréniques, on va également mesurer directement la concentration de dopamine dans le cortex préfrontal de ces souris isolées par microdialyse. En plus, la caractérisation des changements comportementaux chez ces souris isolées est aussi envisagée dans nos perspectives. Une fois terminer, le virus TH astroglial sera ensuite utilisé pour tester si la production dopamine astrogliale restaure le phénotype wild-type de ces souris schizophrénique. L'ensemble de ces résultats peut en fin nous aider à mieux comprendre le rôle des astrocytes dans la modulation dopaminergique de l'activité du cortex préfrontal.

  • Titre traduit

    Cross-talk between neurons and glia: the implication of glial cells in the extracellular homeostasis under physiological and pathological conditions.


  • Résumé

    Cerebral ischemia is characterized by an interruption of blood supply to the brain, leading to the deprivation of oxygen and glucose in the brain tissue. The cellular processes that are triggered by cerebral ischemia are complex. The severe reduction in oxygen and glucose can induce a decrease in ATP production, a drastic increase in extracellular K+ concentration, a great change of intracellular and extracellular pH and lactate production, etc. The alteration of energy metabolism within ischemic tissues quickly leads to membrane depolarization and an alteration of the homeostasis of the extracellular environment which will further lead to the formation of cerebral edema. Although many treatments have been proposed to alleviate the damages induced by cerebral ischemia, few are effective because of a lack of specificity and/or because of the deleterious side effects. In this context, treatment with moderate hypothermia represents an interesting approach, which would have few side effects. In the first part of my Ph.D., I studied cerebellar ischemia by analyzing the effects of temperature on the response of Bergmann's glia (BG). BG is radial glia of the cerebellar cortex, and recent work of our lab has shown that it responds to oxygen and glucose deprivation (OGD) through membrane depolarization and a significant increase in the concentration of cytosolic Ca2+. OGD experiments were then carried out under two conditions: at temperatures close to physiological temperature (31 ° -33 ° C) and at lower temperatures (21 ° -23 ° C). Using electrophysiological approaches (patch-clamp and K + sensitive microelectrodes), it has been shown that lowering the temperature of the extracellular medium induces a significant delay in the response of BG to OGD. In particular, the depolarization of the membrane which is due to an increase of [K+]e, exhibits a kinetics that is approximately 2 times slower than under more physiological conditions. In addition, to study the mechanisms underlying the formation of edema, we quantified on the one hand the global swelling of the cerebellar tissue and on the other hand the change of BG's volume. The results indicate that during OGD the entire molecular layer of the cerebellum swells dramatically. On the other hand, during OGD, the morphological change of BG depends on its different parts: the cell body of BG shrinks, while the glia limitans swell. And again, a decrease in temperature significantly slows down the morphological change in BG. These results show that, during an ischemic episode in the cerebellum, the low temperature reduces the deleterious effects and slows the kinetics of potassium and water homeostasis, a process in which BG appears to participate. After joining the new team Astrocyte and Cognition, I continue to study neuroglial interaction but in relation to the team's main project aimed at understanding the role of astrocytes in the dopaminergic modulation of the prefrontal cortex's activities. The prefrontal cortex is important for integrating different information and is therefore essential for cognitive functions, including decision making, planning, and working memory, etc. The prefrontal cortex is subjected to strong monoaminergic neuromodulations, in particular by dopamine from the VTA. This is evidenced by diseases like schizophrenia or Parkinson's disease which have disorders of dopaminergic homeostasis in the prefrontal cortex. It is therefore important to study the dopaminergic modulation of the activity of the prefrontal cortex. In the first part, by electrophysiological and pharmacological approaches, we studied the signaling pathway of the dopamine-induced modulation of D-serine – a coagonist of the NMDA receptor. In this study, the AC-cAMP-PKA signaling cascade was shown to be the key pathway for dopaminergic modulation of D-serine function. This is important because, this study showed an interaction between the dopamine receptor and the NMDA receptor, which may provide new insight into the two hypotheses proposed for schizophrenia, including the glutamatergic deregulation hypothesis and the dopaminergic deregulation hypothesis. As a gliotransmitter, D-serine can be released by astrocytes where there is also the expression of dopamine receptors, thus it is, therefore, important to work on the role of astrocytes in the dopamine modulations of brain functions. And this is the project I'm currently working on. The main question of the project is whether astrocytes can uptake the dopamine released by DAergic afferences, redistribute and release it in the neuropil to regulate neuronal and synaptic activity in the prefrontal cortex To answer this question, I first tested if astroglial DA can modulate neuronal activity in the prefrontal cortex. Using the patch-clamp technique, I assessed neuronal firing in pyramidal neurons before and during loading of the astrocyte network with Dopamine. According to the results, dopamine diffused in the astrocyte network can decrease the excitability of neurons, this is shown by a decrease in the instantaneous frequency of pyramidal neurons after 30 minutes of dialyzing astrocyte with dopamine (25µM). I then tested whether astroglial dopamine can modulate synaptic transmission. To answer this question, I assessed the intracortical synaptic transmission by recording in layer 5 field potentials (field excitatory postsynaptic potential, fEPSP) evoked by stimulation of layer 2 before and during loading the astrocyte with dopamine (25µM). According to the result, astroglial dopamine increases synaptic transmission at the postsynaptic level, and this effect depends on the astroglial network (shown by connexin 30 and 43 double knockout mice) and is mediated by the astroglial vesicular monoamine transporter 2 (VMAT2) (shown by astro-VMAT2 knockout mice). In addition, because VMAT2 is a vesicular transporter and thus suggest a vesicular release of astroglial DA, I also assessed the release of astroglial dopamine by two approaches : 1, Fluorescent False Neurotransmitter 202 (FFN202): This fluorescent probe (ex 370nm / em 458nm) can change its fluorescence upon release from the vesicle to extracellular space as a result of the change in pH. By using the FFN202, we saw the diffusion of FFN202 inside the astroglial network. However, we currently only have access to a 405nm laser which is not optimal for exciting FFN202, thus it prevented us from better visualizing the release of FFN202 in the prefrontal cortex. To improve the visualization of FFN202, I thus need to repeat the experiment using a 2-photon microscope which will enable us to excite FFN202 at the optimal wavelength. 2, G-protein-coupled receptor-activation-based DA, GRABDA: This is a recently engineered fluorescent probe to detect DA release. These probes are modified dopamine receptors that can emit fluorescence upon binding of dopamine. We have already performed a stereotaxic injection of the virus carrying the GRABDA construct into the prefrontal cortex. The idea is to infect the PFC cells and then specifically stimulate the astrocytes to observe the pattern of the dopamine release. With a pharmacological or chemogenetic stimulation of astrocytes, we hope that the GRABDA probes could detect the astroglial release of dopamine by assessing the change of its fluorescence. With these approaches, we can characterize the diffusion and release pattern of dopamine inside the astroglial network not only in wild-type mice but also in transgenic mice to study the mechanism involved. These results show that astroglial dopamine can modulate neuronal and synaptic activity, and moreover, astrocytes can regulate extracellular dopamine homeostasis, astrocytes could thus represent a novel therapeutic target for those diseases associated with frontal hypodopaminergia such as schizophrenia. I therefore sought to characterize the physiological and behavioral deficits in a mouse model of SCZ to test whether these impairments can be alleviated by viral delivery of Tyrosine hydroxylase in prefrontal cortex astrocytes. To study schizophrenia, we used a developmental mouse model which is induced by social isolation after weaning for 1-2 months. By using electrophysiological approaches in the prefrontal cortex, I found that in the isolated group, there is a significant increase in synaptic transmission compared to the wild-type group. However, the induction of long-term potentiation was not altered in these isolated mice, which suggests no alteration of synaptic plasticity by social isolation. What is now needed for this part of the project is to further characterize changes in synaptic transmission by intracellular recordings for excitatory and inhibitory current. To better understand the hypodopaminergic changes in these schizophrenic mice, we will also directly measure the concentration of dopamine in the prefrontal cortex by microdialysis. In addition, the characterization of behavioral changes in these isolated mice is also expected in our perspectives. Finally, the astroglial TH virus will then be used to test whether astroglial production of dopamine restores the wild-type phenotype of these schizophrenic mice. Taken together, these results may ultimately help us better understand the role of astrocytes in the dopaminergic modulation of prefrontal cortex activities.