Rôle des modifications des ARN dans la fidélité de la traduction chez les eucaryotes

par Charlène Valadon

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Olivier Namy et de Karen Perronet.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne) , en partenariat avec Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC) (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2018 .


  • Résumé

    La traduction des ARNm est assurée par le ribosome qui, associé à une multitude de facteurs, va synthétiser une protéine en fonction du message génétique porté par l'ARNm. Notre vision du ribosome et de l'appareil traductionnel a fortement changé ces dernières années. En effet, nous sommes passés d'une vision passive dans laquelle le ribosome ne joue aucun rôle régulateur par lui même, à une vision dynamique dans laquelle le ribosome est un acteur majeur des régulations traductionnelles au travers des modifications chimiques qu'il subit. En particulier, il a été montré que les conditions environnementales (nutriment), que l'état de la cellule (cellule saine vs cellule cancéreuse), mais aussi les stress (hypoxie, oxydatif) influencent l'état de modifications des ARNr. Ces observations ont amené au concept ribosome spécialisé. C'est-à-dire qu'il n'existerait pas une population de ribosome homogène dans la cellule, mais qu'au contraire il existerait des sous-populations de ribosomes ayant des spécificités différentes. Dans le cadre d'un projet soutenu par l'ANR, nous avons participé à confirmer cette notion de ribosome spécialisé au travers d'une étude sur les variations des 2'-O-méthylation de l'ARNr (Erales J. et al. PNAS 2017). Les ARNt sont eux aussi modifiés de manière post-transcriptionnelle. Avec plus de 50 modifications chimiques recensées, ce sont même les ARN les plus fortement modifiés. Ces modifications jouent soit un rôle dans la structure de l'ARNt soit dans sa capacité à décoder le code génétique. Ces modifications dynamiques sont importantes pour assurer une fidélité optimale de décodage tout en conservant une certaine flexibilité. Nous avons récemment mis en évidence un rôle central de ces modifications chez la levure Saccharomyces cerevisiae dans les erreurs traductionnelles et notamment lors de l'incorporation d'un ARNt naturel au niveau d'un codon stop (translecture) (Blanchet S. et al. PNAS in press). Cependant le rôle de ces modifications dans les cellules humaines demeure très peu étudié. En particulier le rôle dans la fidélité de la traduction de certaines modifications, tel que l'ajout d'un sucre galactose ou mannose et d'une queuonine dans l'antidocon des ARNt Tyr ou Asp (figure 1), qui sont absentes chez la levure, n'ont à ce jour jamais été étudié, même s'il a été décrit que la présence de ces modifications change au cours du développement ou dans les cellules cancéreuses. En plus de ces ARNt, nous nous intéresserons aussi aux modifications présentes dans la boucle anticodon des ARNt suppresseurs naturels humains (Tyr, Gln, Lys pour les codons UAA et UAG, et Trp, Cys, Arg pour le codon UGA) qui permettent d'étudier précisément comment des ARNt 'proches cognats' (2 appariements sur 3 entre le codon et l'anticodon) sont sélectionnés sans être gênés par l'ARNt cognat. Malgré l'accumulation de données génétiques et biochimiques, l'impact de ces modifications (ARNr et ARNt) sur la cinétique de la traduction demeure totalement inexploré. Le projet de thèse aura donc pour objectif d'obtenir des données quantitatives et qualitatives sur l'importance des modifications des ARNr et ARNt lors du décodage du code génétique dans les cellules humaines. Pour cela le projet s'articulera autour de plusieurs axes : - Déterminer l'importance de la modification pour la mis-incorporation des ARNt considérés par LC MS/MS en collaboration avec la plateforme SICaPS d'IMAGIF. - Purification de ribosomes ayant des niveaux de modifications différents, puis étude cinétique en molécule unique de ces ribosomes. - Impact sur la cinétique et l'efficacité de traduction de l'absence de certaines modifications présentes dans l'anticodon des ARNt. - Développement de nouveaux systèmes rapporteurs pour suivre la traduction en temps réel dans une cellule eucaryote (SUNtag). - Etude par ribosome profiling de l'impact sur la cellule humaine de l'absence de certaines modifications dans l'anticodon des ARNt. Afin de déterminer si certains ARNm sont plus sensibles que d'autres à la présence de ces modifications. Ce projet est fortement interdisciplinaire puisque l'aspect qualitatif repose non seulement sur une approche en molécule unique mise au point dans l'équipe en collaboration avec une équipe de physicien (Karen Perronet) de l'institut d'optique graduate school de Palaiseau, mais aussi sur une quantification précise des ARNt incorporés qui est réalisée par spectrométrie de masse en collaboration avec David Cornu de la plateforme SICaps d'IMAGIF. Ces approches seront complétées par des approches moléculaires, génétiques et en microscopie optique. Ce projet permettra notamment la mise au point d'outils innovants (tel que le SUNTAG et ses dérivés) qui nous donneront accès à la cinétique de traduction en temps réel dans la cellule. L'ensemble de ces approches de pointes permettra de déterminer l'importance de ces modifications dans la lecture du code génétique, mais aussi le rôle joué par ces modifications dans l'adaptation des cellules à leur environnement. Références récentes de l'équipe sur cette thématique : (* corresponding author, # Etudiant de l'école doctorale) 1. Blanchet S#, Cornu D, Hatin I, Grosjean H, Bertin P, Namy O*. Deciphering the reading of the genetic code by near-cognate tRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. (in press) 2. Erales J, Marchand V, Panthu B, Gillot S#, Belin S, Ghayad SE, Garcia M, Laforêts F, Marcel V, Baudin-Baillieu A, Bertin P, Couté Y, Adrait A, Meyer M, Therizols G, Yusupov M, Namy O, Ohlmann T, Motorin Y, Catez F, Diaz JJ. Evidence for rRNA 2'-O-methylation plasticity: Control of intrinsic translational capabilities of human ribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. Dec 5; 114 (49):12934-12939. 3. Bugaud O#, Barbier N#, Chommy H#, Fiszman N, Le Gall A, Dullin D, Saguy M, Westbrook N, Perronet K, Namy O*. Kinetics of CrPV and HCV IRES-mediated eukaryotic translation using single molecule fluorescence microscopy. RNA 2017. 23:1626–1635. 4. Thiaville PC#, Legendre R, Rojas-Benítez D, Baudin-Baillieu A, Hatin I, Chalancon G, Glavic A, Namy O*, de Crécy-Lagard, V*. Global translational impacts of the loss of the tRNA modification t6A in yeast. Microbial Cell. 2016 Vol. 3, No. 1, pp. 29 – 45 5. Legendre R, Baudin-Baillieu A, Hatin I, Namy O*. RiboTools: a Galaxy toolbox for qualitative ribosome profiling analysis. Bioinformatics. 2015 Aug 1;31(15):2586-8. 6. Blanchet S#, Cornu D, Argentini M, Namy O*. New insights into the incorporation of natural suppressor tRNAs at stop codons in Saccharomyces cervisiae. Nucleic Acids Res. 2014 ; 42(15) :10061-72 7. Thiaville PC#, El Yacoubi B, Perrochia L, Hecker A, Prigent M, Thiaville J, Forterre P, Namy O, Basta T, De Crecy-Lagard V. Cross Kingdom Functional Conservation of the Core Universally Conserved Threonylcarbamoyladenosine tRNA Synthesis Enzymes. Eukaryot Cell. 2014 ; 13(9) 1222-31

  • Titre traduit

    Impact of RNA modifications on translation fidelity in eukaryotes


  • Résumé

    The translation of the RNA is performed by the ribosome which, associated with a multitude of factors, synthesize a protein according to the genetic message carried by the mRNA. Our vision of the ribosome and the translation apparatus has changed dramatically in recent years. Indeed, we went from a passive vision in which the ribosome plays no regulatory role by itself, to a dynamic vision in which the ribosome is a major player in translational regulation through chemical modifications it undergoes. In particular, it was shown that environmental conditions (nutrient), the state of the cell, but also the stresses (hypoxia, oxidative) influence the state of rRNA modifications. These observations lead to the specialized ribosome concept, where there is not a homogeneous ribosome population in the cell, but on the contrary, there are ribosome subpopulations with different specificities. As part of a project supported by the ANR, we participated in the demonstration of specialized ribosome through a study on the variations of 2'-O-methylation of rRNA (Erales J. et al. PNAS 2017). tRNAs are also modified post-transcriptionally. With over 50 chemical changes identified, these are even the most heavily modified RNAs. These modifications play either a role in the structure of tRNA or in its ability to decode the genetic code. These dynamic modifications are important to ensure optimal decoding fidelity while maintaining flexibility to read alternative codons. We have recently demonstrated a central role of these modifications in the yeast Saccharomyces cerevisiae in translational errors and in particular during the incorporation of a natural tRNA at a stop codon (readthrough) (Blanchet S. et al. PNAS in press). However, the role of these modifications in human cells remains very poorly studied. In particular, the role in the fidelity of the translation of certain modifications, such as the addition of a galactose or mannose sugar and a queuonine in the antidocon of Tyr or Asp tRNAs (FIG. 1), which are absent in the yeast, have never been studied to date, although it has been described that the presence of these changes changes during development or in cancer cells. In addition to these tRNAs, we will also look at the modifications present in the anticodon loop of human natural suppressor tRNAs (Tyr, Gln, Lys for the UAA and UAG codons, and Trp, Cys, Arg for the UGA codon) that make it possible to precisely study how 'near cognate' tRNAs (2 out of 3 pairings between the codon and the anticodon) are selected without being hampered by cognate tRNA. Despite the accumulation of genetic and biochemical data, the impact of these modifications (rRNA and tRNA) on the kinetics of translation remains totally unexplored. The thesis project will therefore aim to obtain quantitative and qualitative data on the importance of rRNA and tRNA modifications during the decoding of the genetic code in human cells. The project will be structured around several axes: - Determine the importance of the modification for mis-incorporation of the considered tRNAs by LC MS / MS in collaboration with IMAGIF's SICaPS platform. - Purification of ribosomes with different levels of modification, then kinetic study in single molecule of these ribosomes. - Impact on the kinetics and translation efficiency of the absence of certain modifications present in the tRNA anticodon. - Development of new reporter systems to track real-time translation in a eukaryotic cell (SUNtag). - Studying by ribosome profiling the impact on the human cell of the absence of certain modifications in the anticodon tRNAs. To determine if some mRNAs are more sensitive than others to the presence of these modifications. This project is highly interdisciplinary since the qualitative aspect is based not only on a single molecule approach developed in the team in collaboration with a physicist team (Karen Perronet) from the Institut Optique Graduate School of Palaiseau, but also on a precise quantification of the incorporated tRNAs which is carried out by mass spectrometry in collaboration with David Cornu of the SICaps platform of IMAGIF. These approaches will be complemented by molecular, genetic and optical microscopy approaches. This project will allow the development of innovative tools (such as SUNTAG and its derivatives) that will give us access to real-time translation kinetics in the cell. These cutting-edge approaches will make it possible to determine the importance of these modifications in the reading of the genetic code, but also the role played by these modifications in the adaptation of cells to their environment. Selected references from our group. (* corresponding author, # former or current PhD student) 1. Blanchet S#, Cornu D, Hatin I, Grosjean H, Bertin P, Namy O*. Deciphering the reading of the genetic code by near-cognate tRNA. Proc Natl Acad Sci U S A. (in press) 2. Erales J, Marchand V, Panthu B, Gillot S#, Belin S, Ghayad SE, Garcia M, Laforêts F, Marcel V, Baudin-Baillieu A, Bertin P, Couté Y, Adrait A, Meyer M, Therizols G, Yusupov M, Namy O, Ohlmann T, Motorin Y, Catez F, Diaz JJ. Evidence for rRNA 2'-O-methylation plasticity: Control of intrinsic translational capabilities of human ribosomes. Proc Natl Acad Sci U S A. Dec 5; 114 (49):12934-12939. 3. Bugaud O#, Barbier N#, Chommy H#, Fiszman N, Le Gall A, Dullin D, Saguy M, Westbrook N, Perronet K, Namy O*. Kinetics of CrPV and HCV IRES-mediated eukaryotic translation using single molecule fluorescence microscopy. RNA 2017. 23:1626–1635. 4. Thiaville PC#, Legendre R, Rojas-Benítez D, Baudin-Baillieu A, Hatin I, Chalancon G, Glavic A, Namy O*, de Crécy-Lagard, V*. Global translational impacts of the loss of the tRNA modification t6A in yeast. Microbial Cell. 2016 Vol. 3, No. 1, pp. 29 – 45 5. Legendre R, Baudin-Baillieu A, Hatin I, Namy O*. RiboTools: a Galaxy toolbox for qualitative ribosome profiling analysis. Bioinformatics. 2015 Aug 1;31(15):2586-8. 6. Blanchet S#, Cornu D, Argentini M, Namy O*. New insights into the incorporation of natural suppressor tRNAs at stop codons in Saccharomyces cervisiae. Nucleic Acids Res. 2014 ; 42(15) :10061-72 7. Thiaville PC#, El Yacoubi B, Perrochia L, Hecker A, Prigent M, Thiaville J, Forterre P, Namy O, Basta T, De Crecy-Lagard V. Cross Kingdom Functional Conservation of the Core Universally Conserved Threonylcarbamoyladenosine tRNA Synthesis Enzymes. Eukaryot Cell. 2014 ; 13(9) 1222-31