Amélioration de la classification moléculaire des tumeurs hépatocellulaires bénignes : vers la mise en place d'outils diagnostics

par Gabrielle Couchy

Projet de thèse en Biologie cellulaire et moléculaire et sciences de la santé

Sous la direction de Flore Renaud-Paitra et de Jessica Zucman-rossi.

Thèses en préparation à Paris Sciences et Lettres , dans le cadre de École doctorale de l'École pratique des hautes études (Paris) , en partenariat avec Immunologie intégrative des tumeurs et génétique oncologique (laboratoire) et de École pratique des hautes études (Paris) (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    Les adénomes hépatocellulaires (AHC) sont des tumeurs bénignes rares répartit selon la présence de mutations inactivatrices de HNF1a, de mutations activatrices de la ß-caténine codant pour le gène CTNNB1 et l'activation de la voie IL6/JAK/STAT. Toutefois, un faible nombre d'AHC reste sans caractéristiques spécifiques. Nous avons cherché à affiner la classification moléculaire des AHC et à identifier les associations existantes entre les caractéristiques cliniques et moléculaires de chaque sous-groupes AHC. Pour cela, un recrutement sur vingt ans de 533 AHC pour 433 patients a été réalisé. J'ai procédé au séquençage par méthode Sanger des 10 gènes connu pour être muté dans les AHC, et analysé par RT-PCR quantitative l'expression de 20 gènes significativement déréguler dans les différents groupes moléculaires d'AHC. Après l'analyse moléculaire des 533 AHC, selon leurs altérations génétiques, moléculaires et immunohistochimique, cependant 11% des AHC restent inclassés. La première partie du projet de thèse a été d'identifier les altérations génétiques et moléculaires impliquées dans la tumorigenèse de ces AHC « inclassés ». Nous avons réalisé une analyse des données transcriptomiques par puces Affymétrix de 4 foies normaux et 36 adénomes des différents groupes moléculaires. La comparaison des profils d'expression entre les AHC inclassés et les foies normaux a permis d'identifier des gènes significativement différentiellement exprimés entre les deux entités. L'étude GSEA (Gene Set Enrichissement Analyse) des gènes surexprimés a permis d'identifier une activation de la voie Sonic Hedgehog dans 4 des 8 AHC « inclassés » suggérant qu'un nouveau sous-groupe d'adénome hépatocellulaire était défini par une activation de la voie sonic hedgehog (appelé Sonic Hedgehog AHC shAHC). Par ailleurs, une analyse de RNAseq des d'AHC « inclassés » a été réalisé et mis en évidence une petite délétion du gène INHBE qui conduit à la formation d'un gène fusion entre le gène INHBE et les exon 2 et 4 de du gènes GLI1. Nous avons donc identifié un nouveau sous-groupe d'adénome (shHCA, 4%), auparavant inclassé, caractérisé par l'activation de la voie Sonic hedgehog secondaire à la présence d'un gène de fusion INHBE-GLI1. Cette découverte souligne pour la première fois l'importance de la voie sonic hedgehog dans la tumorigénèse hépatique bénigne chez l'homme. Afin d'identifier les mécanismes induits par l'activation de la voie Sh, j'effectues une étude fonctionnelle en transfectant des lignées cellulaires soit en inhibant ou en surexprimant l'expression de GLI1, ainsi je pourrais définir de nouvelles cibles thérapeutiques pour une prise en charges personnalisé pour les patients ayant un shAHC. Dans un deuxième temps, dans le but de mettre en évidence des associations entre les caractéristiques cliniques et moléculaires des différents groupes d'AHC, un recueil et une analyse des données cliniques et biologiques des 411 patients des 533 AHC a été effectué. En effet, La confrontation des caractéristiques histologiques, cliniques et moléculaires de chacun des 8 groupes d'AHC a affiné notre connaissance des facteurs de risque, des caractéristique cliniques, histologiques lié à chaque groupe moléculaire. Dans ce sens, nous avons montré que le nouveau sous-groupe d'adénome shHCA était associé un à risque plus élevé d'hémorragie histologique et clinique. En pratique clinique, l'identification des tumeurs présentant des caractères à risque de transformation maligne ou hémorragique permettra de proposer dans le futur des prises en charge à la carte adaptée au profil moléculaire des tumeurs.

  • Titre traduit

    Improvement of the molecular classification of benign hepatocellular tumors: towards the implementation of diagnostic tools


  • Résumé

    Hepatocellular adenomas (AHC) are rare benign tumors distributed by the presence of inactivating HNF1a mutations, ß-catenin activating mutations encoding the CTNNB1 gene and activation of the IL6 / JAK / STAT pathway. However, a small number of AHC remains without specific characteristics. We sought to refine the molecular classification of HCAs and to identify existing associations between the clinical and molecular characteristics of each AHC subgroup. For this, a recruitment over 20 years of 533 AHC for 433 patients was carried out. I sequenced by Sanger method the genes known to be mutated in the AHCs, and analyzed by quantitative RT-PCR the expression of 20 genes significantly deregulate in the different molecular groups of AHC. After molecular analysis of the 533 AHCs, according to their genetic, molecular and immunohistochemical alterations, however, 11% of the HCAs remain in the range. The first part of the thesis project was to identify the genetic and molecular alterations involved in the tumorigenesis of these "unclassified" AHCs. We performed an analysis of the transcriptomic data by Affymétrix chips of 4 normal livers and 36 adenomas of the different molecular groups. Comparison of expression patterns between clumped HCAs and normal livers resulted in the identification of genes significantly differentially expressed between the two entities. The GSEA (Gene Set Enrichment Analysis) study of the overexpressed genes identified an activation of the Sonic Hedgehog pathway in 4 of the 8 "clustered" AHCs suggesting that a new subgroup of hepatocellular adenoma was defined by an activation Of the sonic hedgehog path (called Sonic Hedgehog AHC shAHC). On the other hand, RNAseq analysis of the "clustered" AHCs was carried out and revealed a small deletion of the INHBE gene which leads to the formation of a fusion gene between the INHBE gene and exon 2 and 4 of the genes GLI1. We have thus identified a new subgroup of adenoma (shHCA, 4%), previously included, characterized by activation of the Sonic hedgehog pathway secondary to the presence of an INHBE-GLI1 fusion gene. This discovery highlights for the first time the importance of the sonic hedgehog pathway in benign hepatic tumorigenesis in humans. In order to identify the mechanisms induced by the activation of the Sh pathway, I perform a functional study by transfecting cell lines either by inhibiting or overexpressing GLI1 expression, thus I could define new therapeutic targets for a In personalized load for patients with a shAHC. Secondly, in order to demonstrate associations between the clinical and molecular characteristics of the different groups of HCAs, a collection and analysis of the clinical and biological data of the 411 patients of the 533 AHCs was carried out. Indeed, the confrontation of the histological, clinical and molecular characteristics of each of the 8 groups of HCA has refined our knowledge of the risk factors, the clinical characteristics, histological linked to each molecular group. In this sense, we showed that the new subgroup of adenoma shHCA was associated with a higher risk of histological and clinical haemorrhage. In clinical practice, the identification of tumors with characteristics at risk of malignant or haemorrhagic transformation will allow us to propose, in the future, tailor-made management adapted to the molecular profile of tumors.