Découverte de novo de marqueurs thérapeutiques dans le carcinome hépatocellulaire

par Ander Churruca Schuind

Projet de thèse en Biologie Santé

Sous la direction de Antonio Maraver, Roberto Ronca et de Andrei Turtoi.

Thèses en préparation à Montpellier en cotutelle avec l'Université de Brescia , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé (Montpellier ; Ecole Doctorale ; 2015-....) , en partenariat avec IRCM - Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier (laboratoire) et de Voies oncogéniques dans le cancer du poumon. (equipe de recherche) depuis le 01-11-2017 .


  • Résumé

    Le carcinome hépatocellulaire (HCC en anglais) est le sixième cancer par incidence et le troisième par mortalité. Le traitement clinique du HCC est compliqué. À part de la greffe de foie per une minorité de patients opérables, il n'existe actuellement aucun traitement efficace pour éradiquer le HCC. Les essais clinques en cours explorent principalement l'usage de molécules à bas poids moléculaire désignés pour le traitement d'autres maladies. Ces thérapies ont obtenu un succès limité dans le traitement d'autres tumeurs. Les anticorps couplés à des molécules cytotoxiques (antibody drug conjugates, ADC, en anglais) sont de dérivés puissants des anticorps classiques, capables de transporter des molécules cytotoxiques directement à la tumeur. Malheureusement, au présent seulement un ADC est prouvé efficace pour combattre le HCC (l'anticorp anti-TROP2, couplé avec irinotecan). En conséquence, la découverte de nouvelles cibles compatibles avec le système ADC est totalement nécessaire pour le traitement de le HCC. Le site tumoral est compose par deux compartiments différenciés: la tumeur – un group de cellules prolifératives et malignes – et le stroma tumoral. Le stroma est formé par des cellules non malignes mais qui présentent un phénotype protumoral. Dans les premiers étages de la progression tumorale, les facteurs secrétés par les cellules de la tumeur, produisent de changement de comportement et phénotype dans les cellules stromales. C'est le cas pour les fibroblastes associés au cancer (CAF en anglais) et les macrophages associé à la tumeur (TAM en anglais), qui jouent un rôle essentiel dans la progression tumoral. Ayant en considération que le microambiant de la tumeur n'est pas encore bien décrit, nous cherchions d'établir des cibles atteignables, c'est-à-dire, des protéines de membrane ou extracellulaires, qui peuvent être reconnus par des anticorps livrés systématiquement. Cette étude est motivée par la nécessité, non satisfaite, des cibles efficaces et atteignables pour le HCC, visant la découverte de novo de biomarqueurs tumoraux accessibles. Ces protéines ont été identifiées a partir de tissue de HCC humain et en parallèle de tissue hépatique normale de 5 patients. Les biopsies sont été submergées dans un réactif de biotinylation (sulfo NHS-SS biotine), et les protéines désirées ont été isolées par colonne d'affinité de streptavidine. L'identification et quantification des protéines isolées sont été faites par une méthode protéomique assisté par spectrométrie de masse. L'analyse identifia plus de 1500 protéines ciblables, dont au moins 200 sont exclusivement présent dans HCC. L'évaluation bioinformatique centré seulement sur les protéines dont ont connait la localisation subcellulaire, nous a donné au moins 20 nouveaux candidats thérapeutiques. Ces informations ont été validées par des études d'immunohistochimie dans une cohorte de patients plus nombreuse (n=200), obtenant une confirmation de la surexpression de certaines protéines dans le HCC. Des efforts sont en cours pour explorer les fonctions biologiques des cibles choisis, ainsi que leur pertinence pour l'usage come biomarqueurs thérapeutiques. Pour réussir une évaluation complète des rôles des nouveaux biomarqueurs protéiques dans le HCC, nous proposions une conception expérimentale classique in vivo/in vitro. Premièrement nous voulons déterminer la présence et fonction des protéines choisies dans des lignes cellulaires de HCC, utilisant des techniques de Biologie Cellulaire. Pour analyser la fonction de ces cibles dans un contexte in vivo, on ferra des expériences sur des modèles murines. Considérant l'importance de l'angiogenèse dans la progression tumoral, nous ferrons des expériences dans de model in vivo et ex vivo. Les expériences in vitro et in vivo, avec les résultats de la immunohistochemie, clarifieront les mécanismes de la progression du HCC, et aideront a la découverte de nouveaux biomarqueurs protéiques, utiles pour le design des nouveaux médicaments. Le site tumoral est compose par deux compartiments différenciés: la tumeur – un group de cellules prolifératives et malignes – et le stroma tumoral. Le stroma est formé par des cellules non malignes mais qui présentent un phénotype protumoral. Dans les premiers étages de la progression tumorale, les facteurs secrétés par les cellules de la tumeur, produisent de changement de comportement et phénotype dans les cellules stromales. C'est le cas pour les fibroblastes associés au cancer (CAF en anglais) et les macrophages associé à la tumeur (TAM en anglais), qui jouent un rôle essentiel dans la progression tumoral. Ayant en considération que le microambiant de la tumeur n'est pas encore bien décrit, nous cherchions d'établir des cibles atteignables, c'est-à-dire, des protéines de membrane ou extracellulaires, qui peuvent être reconnus par des anticorps livrés systématiquement. Cette étude est motivée par la nécessité, non satisfaite, des cibles efficaces et atteignables pour le HCC, visant la découverte de novo de biomarqueurs tumoraux accessibles. Ces protéines ont été identifiées a partir de tissue de HCC humain et en parallèle de tissue hépatique normale de 5 patients. Les biopsies sont été submergées dans un réactif de biotinylation (sulfo NHS-SS biotine), et les protéines désirées ont été isolées par colonne d'affinité de streptavidine. L'identification et quantification des protéines isolées sont été faites par une méthode protéomique assisté par spectrométrie de masse. L'analyse identifia plus de 1500 protéines ciblables, dont au moins 200 sont exclusivement présent dans HCC. L'évaluation bioinformatique centré seulement sur les protéines dont ont connait la localisation subcellulaire, nous a donné au moins 20 nouveaux candidats thérapeutiques. Ces informations ont été validées par des études d'immunohistochimie dans une cohorte de patients plus nombreuse (n=200), obtenant une confirmation de la surexpression de certaines protéines dans le HCC. Des efforts sont en cours pour explorer les fonctions biologiques des cibles choisis, ainsi que leur pertinence pour l'usage come biomarqueurs thérapeutiques. Pour réussir une évaluation complète des rôles des nouveaux biomarqueurs protéiques dans le HCC, nous proposions une conception expérimentale classique in vivo/in vitro. Premièrement nous voulons déterminer la présence et fonction des protéines choisies dans des lignes cellulaires de HCC, utilisant des techniques de Biologie Cellulaire. Pour analyser la fonction de ces cibles dans un contexte in vivo, on ferra des expériences sur des modèles murines. Considérant l'importance de l'angiogenèse dans la progression tumoral, nous ferrons des expériences dans de model in vivo et ex vivo. Les expériences in vitro et in vivo, avec les résultats de la immunohistochemie, clarifieront les mécanismes de la progression du HCC, et aideront a la découverte de nouveaux biomarqueurs protéiques, utiles pour le design des nouveaux médicaments.

  • Titre traduit

    De Novo Discovery of Therapeutic Markers in Hepatocellular Carcinoma


  • Résumé

    Hepatocellular carcinoma (HCC) is world's sixth most common and third most deadly malignancy. The clinical management of HCC is difficult. Apart from liver transplantation in a minority of operable patients, there is currently no effective treatment to eradicate HCC. On-going clinical trials are exploring predominantly small molecules that have not been specifically tailored for HCC. Such therapies have shown only modest success in other types of tumors. Antibody-drug conjugates (ADC) are potent derivatives of classical antibodies that are able to deliver cytotoxic payloads to the tumor. Unfortunately, today only one ADC is tested for efficacy in HCC (anti-TROP2 antibody conjugated with irinotecan), suggesting that new ADC-compatible targets for HCC are desperately needed. The tumour site is composed by two distinct compartments: the tumour itself - a bulk of proliferating malignant cells - and the tumour stroma. The stroma is constituted by non-malignant cells with an altered pro-tumoral phenotype. In the early stages of tumour development, tumour cell derived factors act on normal cells in the tissue, inducing a pro-tumoral phenotype and behaviour. This is the case for cancer associated fibroblasts (CAFs) and tumour associated macrophages (TAMs), key players in tumour development. Considering that the role of tumour microenvironment remains obscure, we seek to find accessible proteins, i.e. membrane-bound and extracellular proteins, that are reachable by systemically delivered homing antibodies. The present study is motivated by the unmet need of efficiently reachable targets in HCC, aiming at a de novo discovery of accessible tumor biomarkers. The isolation of accessible proteins was performed using fresh human HCC tissues as well as matched normal livers from 5 individual patients. Fresh biopsies were first soaked in biotinylation reagent (Sulfo NHS-SS biotin), followed by isolation of target proteins using streptavidin affinity columns. The isolated proteins were further identified and quantified owing to an MS-assisted proteomic approach. The analysis identified over 1500 potentially accessible proteins, of which at least 200 targets were uniquely expressed in HCC. Bioinformatic evaluation focusing exclusively on proteins with known subcellular localization revealed more than 20 novel therapeutic candidates. Validation studies using immunohistochemistry on a larger cohort of patients (N=200), confirmed the overexpression of several selected proteins in HCC. Current efforts are underway to explore the biological function of selected targets and their suitability for being used as therapeutic biomarkers. To fully evaluate the role of novel protein biomarkers in HCC, we propose a classical in vitro/in vivo experimental design. We first seek to determine the presence and function of chosen proteins in HCC model cell lines, through cell biology techniques. To assess the role of novel targets in an in vivo context, experiments in murine models will be carried out. Special attention will be drawn over angiogenesis, considering its importance in tumor development, and experiments will be fulfilled both in in vitro an ex vivo models. In vitro and in vivo experiments, together with immunohistochemical studies in human patients will shed light on HCC, and it will ease the discovery of novel protein biomarkers, useful for the design of new and necessary targeting drugs. The tumour site is composed by two distinct compartments: the tumour itself - a bulk of proliferating malignant cells - and the tumour stroma. The stroma is constituted by non-malignant cells with an altered pro-tumoral phenotype. In the early stages of tumour development, tumour cell derived factors act on normal cells in the tissue, inducing a pro-tumoral phenotype and behaviour. This is the case for cancer associated fibroblasts (CAFs) and tumour associated macrophages (TAMs), key players in tumour development. Considering that the role of tumour microenvironment remains obscure, we seek to find accessible proteins, i.e. membrane-bound and extracellular proteins, that are reachable by systemically delivered homing antibodies. The present study is motivated by the unmet need of efficiently reachable targets in HCC, aiming at a de novo discovery of accessible tumor biomarkers. The isolation of accessible proteins was performed using fresh human HCC tissues as well as matched normal livers from 5 individual patients. Fresh biopsies were first soaked in biotinylation reagent (Sulfo NHS-SS biotin), followed by isolation of target proteins using streptavidin affinity columns. The isolated proteins were further identified and quantified owing to an MS-assisted proteomic approach. The analysis identified over 1500 potentially accessible proteins, of which at least 200 targets were uniquely expressed in HCC. Bioinformatic evaluation focusing exclusively on proteins with known subcellular localization revealed more than 20 novel therapeutic candidates. Validation studies using immunohistochemistry on a larger cohort of patients (N=200), confirmed the overexpression of several selected proteins in HCC. Current efforts are underway to explore the biological function of selected targets and their suitability for being used as therapeutic biomarkers. To fully evaluate the role of novel protein biomarkers in HCC, we propose a classical in vitro/in vivo experimental design. We first seek to determine the presence and function of chosen proteins in HCC model cell lines, through cell biology techniques. To assess the role of novel targets in an in vivo context, experiments in murine models will be carried out. Special attention will be drawn over angiogenesis, considering its importance in tumor development, and experiments will be fulfilled both in in vitro an ex vivo models. In vitro and in vivo experiments, together with immunohistochemical studies in human patients will shed light on HCC, and it will ease the discovery of novel protein biomarkers, useful for the design of new and necessary targeting drugs.