La pompe à efflux multidrogue de type MFS à trois composants EmrAB-TolC d'Escherichia coli : du clonage à l'analyse structurale

par Narek Yousefian

Thèse de doctorat en Biochimie

Sous la direction de Olivier Lambert et de Klaas Martinus Pos.

Thèses en préparation à Bordeaux en cotutelle avec l'Université Johann Wolfgang Goethe de Francfort , dans le cadre de École doctorale Sciences de la vie et de la santé , en partenariat avec Institut de Chimie & de Biologie des Membranes & des Nano-objets (laboratoire) .


  • Résumé

    A l'heure actuelle, suite à une mauvaise utilisation des antibiotiques, nous faisons face à un problème majeur de santé publique. En effet la résistance aux antibiotiques de certaines souches bactériennes rend le traitement des infections très complexe. Dans ce contexte, le présent projet de thèse concerne l'étude d'un complexe d'efflux bactérien capable de transporter des antibiotiques du cytoplasme vers l'extérieur de la cellule. Ce complexe est composé d'un transporteur de la membrane interne appartenant à la Major Facilitator Superfamily (MFS) (EmrB, E. coli multidrug resistance), d'un canal de la membrane externe TolC (Tolerance to Colicin E1) et d'un adaptateur périplasmique (EmrA, E. coli multidrug resistance). Contrairement aux systèmes d'efflux de type RND (tels que AcrAB-TolC), peu de choses sont connues sur le système EmrAB-TolC de type MFS. Il est donc important d'étudier l'ensemble du complexe sur le plan structurale et fonctionnel afin d'identifier les différences entre ces deux types de systèmes d'efflux. L'objectif de mon projet de thèse était d'étudier au moins un complexe EmrAB-TolC d'un point de vue structurale. Ainsi durant mes études, le but était d'isoler le complexe directement des bactéries surexprimant les trois partenaires protéiques. Dans un premier temps, 15 systèmes homologues EmrAB-TolC ont été identifiés et leurs gènes correspondants amplifiés à partir de l'ADN génomique de différentes bactéries à Gram négatif. Parmi les gènes des 15 systèmes, les gènes codant pour les systèmes d'E. coli et de V. cholerae ont été étudiés plus en détail. Les vecteurs d'expression codaient pour des marqueurs fluorescents pour la mesure des niveaux d'expression de différentes protéines et pour l'étude de la formation des complexes. Dans un premier temps, les différents niveaux d'expression des protéines (EmrB-mRFP1 et EmrA-sfGFP) ont été étudiés pour plusieurs souches d'expression d'E. coli en mesurant les niveaux de fluorescence rouge et verte et par Western blot (anti-His, Myc et Strep pour EmrB, EmrA et TolC). La souche d'E. coli C41(DE3) était la mieux adaptée pour la co-expression d'EmrAB-TolC. Dans un deuxième temps, la méthodologie FSEC (Fluorescence detection Size Exclusion Chromatography) a été utilisée pour identifier un complexe adapté à l'étude structurale. Ainsi, cette méthode a permis d'observer que le complexe EmrAB-TolC d'E. coli était produit en plus grande quantité que celui de V. cholerae. Le protocole final de co-purification consiste à effectuer une lyse douce des bactéries à l'aide du lysozyme, puis après solubilisation avec le DDM, la purification est débutée par une étape de chromatographie d'affinité Ni2+-NTA suivie d'une étape de chromatographie d'exclusion stérique. Enfin, les fractions contenant les trois partenaires protéiques sont utilisées pour l'échange de détergent par l'amphipol A8-35 avant l'étude structurale par microscopie électronique. Les images de microscopie électronique en coloration négative montrent des objets allongés d'une longueur de 33 nm en vue de côté. Une image moyenne d'EmrAB-TolC montre des similitudes avec celle du complexe AcrAB-TolC observé dans des conditions similaires. Les similitudes concernent les densités caractéristiques de TolC. Des différences ont été trouvées pour la partie inférieure d'EmrAB qui est plus fine que la partie inférieure d'AcrAB. Les densités visibles au-dessus de l'anneau d'amphipol correspondent à EmrA, qui présente une structure en forme de canal comme observé avec AcrA. Le canal semble cependant s'étendre plus loin vers la ceinture d'amphipol. Comme EmrB n'a pas de domaine périplasmique étendu présent dans le cas des protéines RND, ces densités sont donc uniquement attribuées à EmrA. EmrA, de l'autre côté, contacte TolC de manière similaire à l'interaction d'AcrA/MexA avec leurs canaux de la membrane externe respectifs (TolC/OprM) de façon «tip-to-tip».

  • Titre traduit

    The three-component multidrug MFS-type efflux pump EmrAB-TolC from Escherichia coli: from cloning to structural analysis


  • Résumé

    Currently, due to the misuse of antibiotics, we are facing a major public health problem. The resistance to antibiotics of certain bacterial strains makes the treatment of infections very complex. In this context, the present thesis project concerns the study of a bacterial efflux complex capable of transporting antibiotics from the cytoplasm to the outside of the cell. This complex is composed of an inner-membrane Major Facilitator Superfamily (MFS) transporter (EmrB, E. coli multidrug resistance), a channel of the outer membrane TolC (Tolerance to Colicin E1) and a periplasmic adapter (EmrA, E. coli multidrug resistance). Unlike RND-type efflux systems (such as AcrAB-TolC), little is known about the MFS-type EmrAB-TolC system. It is therefore important to study the entire complex on a structural and functional level, to analyse the marked differences between these two types of transport systems. The goal of my thesis project was to study at least one EmrAB-TolC complex from a structural point of view. For my studies the aim was to isolate the complex directly from bacteria overexpressing the three protein partners. In a first step, 15 homologous EmrAB-TolC systems were identified and their corresponding genes amplified from genomic DNA of different Gram-negative bacteria. Among the genes of the 15 systems, the genes coding for the E. coli and V. cholerae systems were further studied. The expression vectors encoded fluorescent markers for the monitoring of the expression levels of different proteins and for studying the formation of complexes. In a first step, the different protein expression levels (EmrB-mRFP1 and EmrA-sfGFP) were studied for several expression strains of E. coli by measuring the red and green fluorescence levels and by Western blot (anti-His, Myc, and Strep for EmrB, EmrA, and TolC). The E. coli strain C41(DE3) was best suited for co-expression of EmrAB-TolC. In a second step, the FSEC (Fluorescence detection Size Exclusion Chromatography) methodology was used to identify a complex suitable for structural study. Thus this method enabled the observation that the EmrAB-TolC complex of E. coli was produced in higher amount than that of V. cholerae. The final co-purification protocol consists in perfoming a gentle lysis of the bacteria using lysozyme, then after solubilization with DDM, the purification is started by a Ni2+-NTA affinity chromatography step followed by a size exclusion chromatography step. Finally, the fractions containing the three protein partners are used for the detergent-exchange by amphipol A8-35 before the structural study by electron microscopy. Negative stain EM-micrographs displayed elongated objects with a length of 33 nm in side view. An average image of EmrAB-TolC shows similarities to that of the AcrAB-TolC complex observed under similar conditions. Similarities included the characteristic densities of TolC. Whereas differences were found in the lower part of EmrAB which is thinner than the lower part of AcrAB. The densities visible above the amphipol-ring correspond to EmrA, which displays a channel-like structure as in AcrA. The channel however seems to extend further towards the amphipol belt. Since EmrB does not have an extended periplasmic domain as the RND proteins have, these densities are therefore solely assigned to EmrA. EmrA, on the other side, contacts TolC akin to the interaction of AcrA/MexA to their cognate outer membrane channels (TolC/OprM) in a ‘tip-to-tip' fashion.