Développement et caractérisation d'un modèle de macrophages spumeux pour la sélection d'anticorps par phage-display (à visée diagnostique et/ou thérapeutique) dans le cadre de l'athérosclérose

par Coraline Borowczyk

Projet de thèse en Bioimagerie

Sous la direction de Gisèle Clofent-sanchez.

Thèses en préparation à Bordeaux , dans le cadre de Sciences de la Vie et de la Santé , en partenariat avec Franconi (laboratoire) et de Ciblage de l'Athérome (equipe de recherche) depuis le 20-09-2017 .


  • Résumé

    Les maladies cardiovasculaires sont la principale cause de mortalité dans le monde. Dans la majorité des cas, c'est l'athérosclérose - une maladie inflammatoire chronique – qui en est à l'origine. L'athérosclérose est caractérisée par l'accumulation de lipides au niveau de la paroi des artères induisant le développement de plaques athéromateuses. Celles-ci, selon leur composition, vont soit grossir et obstruer le vaisseau, soit se rompre et provoquer des accidents cardiovasculaires. Le développement de ces plaques d'athérome, nommé athérogenèse, fait intervenir de nombreuses cellules du système immunitaire, en majorité les macrophages. Ces derniers jouent un rôle important à toutes les étapes de l'athérogenèse ce qui en fait une cible thérapeutique idéale. Ils ont principalement pour rôle d'éliminer les lipides (LDL oxydées) accumulés dans la paroi artérielle. Mais à partir d'une certaine quantité phagocytée, ces macrophages – devenus spumeux – n'arrivent plus à recycler ces lipides ingérés et se nécrosent. L'objectif est donc de développer un modèle mimant ces macrophages spumeux afin de mieux comprendre les phénomènes physiopathologiques opérant au sein de la plaque, ce qui permettrait de diagnostiquer les plaques à risque de rupture. Ce modèle permet également de pouvoir isoler des anticorps spécifiques de ces plaques (par phage-display) dans l'objectif de développer des traitements thérapeutiques et/ou diagnostiques. Résultats (avancées et difficultés) : Afin de se rapprocher des conditions physiopathologiques rencontrées in vivo, nous avons utilisées des cellules de patients sains (provenant de l'EFS de Bordeaux) qui ont été différenciées en macrophages spumeux en présence de lipides et d'extraits de plaques d'athérome carotidiennes. Les cellules sanguines mononuclées périphériques sont isolées par un gradient de Ficoll puis les monocytes sont récupérés par sélection négative (Pan Monocyte Isolation Kit, Miltenyi Biotec). Pour étudier notre modèle de macrophages spumeux, nous le comparons à des modèles déjà étudiés qui sont les macrophages pro-inflammatoires (M1) et les macrophages immunorégulateurs (M2). Les monocytes purifiés sont différenciés avec du M-CSF pendant 4 à 6 jours puis activés avec du LPS et IFN- pour le modèle M1, de l'IL-4 et IL-13 pour le modèle M2 ou des LDL oxydées +/- extraits de plaques d'athérome carotidiennes de patients (récupérés auprès du Professeur Ducasse, chirurgien au CHU Pellegrin). Les cellules ainsi activées sont analysées par cytométrie en flux pour leurs marqueurs de surface (CD40, CD86, CD197, CD163, CD206 et CD200R) et par microscopie à fluorescence pour suivre l'autofluorescence d'intermédiaires du métabolisme. La cytométrie en flux nous a permis de valider nos modèles de polarisation extrême M1 et M2 grâce aux marqueurs M1 (CD40, CD86, CD197) et M2 (CD206 et CD200R). En ce qui concerne notre modèle de macrophages spumeux, il ressort des études phénotypiques que les marqueurs dit M1 et M2 sont effectivement exprimés sur ce modèles physiopathologiques mais à un niveau plutôt basal si on s'en réfère aux populations extrêmes. Nous allons donc tester dans les prochaines manips de cytométrie en flux d'autres marqueurs, des scavenger receptor, tels que Lox1, CD36 et CD204. En parallèle, nous avons observé notre modèle ainsi que les M1 et M2 en microscopie à fluorescence pour suivre les intermédiaires du métabolisme ; NADH et FAD. D'après la littérature, les M1 utilisent un métabolisme basé sur la glycolyse et peu sur la respiration mitochondriale ; ils accumulent donc beaucoup plus de NADH que de FAD et ont un ratio NADH/FAD élevé. Les M2, au contraire, utilisent plutôt l'oxydation des acides gras et la respiration mitochondriale et présentent, de ce fait, un ratio NADH/FAD beaucoup plus faible que les M1. Nous avons observé la présence de ces intermédiaires grâce à un microscope à fluorescence bi-photonique permettant une mesure plus précise. La quantification a validé les données de la littérature pour nos modèles M1 et M2. Quant au modèle de macrophages spumeux, les résultats tendent vers un ratio NADH/FAD encore plus faible que celui des M2. Nous souhaitons compléter ces études par des études RMN pour étudier les voies du métabolisme préférentiellement utilisées et de protéomique pour établir les profils d'expression protéique. Des études ont déjà été réalisées et les résultats sont en cours de traitement. L'étude de leur respiration est également prévue, le protocole a déjà été validé. Des expériences d'immunohistochimie (IHC) ont également été effectuées afin de valider nos marqueurs étudiés en cytométrie en flux sur des coupes de plaques d'athérome humaines. Enfin, une expérience de phage-display a été réalisée sur le modèle physiopathologique – macrophages activés par des LDLoxydées + extraits de plaques carotidiennes – afin d'isoler des anticorps spécifiques de ces macrophages et donc des plaques d'athérome.

  • Titre traduit

    Development and characterization of a foamy macrophage model for the selection of antibodies by phage-display (for diagnostic and / or therapeutic purposes) in the context of atherosclerosis


  • Résumé

    Cardiovascular disease is the leading cause of death in the world. In the majority of cases, atherosclerosis - a chronic inflammatory disease - is the cause. Atherosclerosis is characterized by the accumulation of lipids in the arterial wall inducing the development of atheromatous plaques. These, depending on their composition, will either grow and clog the vessel or break and cause cardiovascular events. The development of these atheroma plaques, called atherogenesis, involves many cells of the immune system, mostly macrophages. These play an important role in all stages of atherogenesis making it an ideal therapeutic target. Their main role is to eliminate lipids (oxidized LDL) accumulated in the arterial wall. But from a certain amount of phagocytosis, these macrophages - which have become foamy - can no longer recycle these ingested lipids and become necrotic. The objective is to develop a model mimicking these foamy macrophages to better understand the physiopathological phenomena operating within the plate, which would diagnose plates at risk of rupture. This model also makes it possible to be able to isolate antibodies specific for these plaques (by phage-display) with the objective of developing therapeutic and / or diagnostic treatments. Results (progress and difficulties): In order to get closer to the pathophysiological conditions encountered in vivo, we used healthy patient cells (from Bordeaux EFS) that were differentiated into foamy macrophages in the presence of lipids and extracts of carotid atheromatous plaques. Peripheral mononuclear blood cells are isolated by a Ficoll gradient and monocytes are recovered by negative selection (Pan Monocyte Isolation Kit, Miltenyi Biotec). To study our model of foamy macrophages, we compare it to previously studied models that are pro-inflammatory macrophages (M1) and immunoregulatory macrophages (M2). Purified monocytes are differentiated with M-CSF for 4-6 days and then activated with LPS and IFN- for model M1, IL-4 and IL-13 for model M2 or oxidized LDL +/- Carotid atheromatous plaque extracts from patients (recovered from Professor Ducasse, surgeon at CHU Pellegrin). The cells thus activated are analyzed by flow cytometry for their surface markers (CD40, CD86, CD197, CD163, CD206 and CD200R) and by fluorescence microscopy to monitor the autofluorescence of metabolic intermediates. Flow cytometry enabled us to validate our M1 and M2 extreme polarization models using the M1 (CD40, CD86, CD197) and M2 (CD206 and CD200R) markers. With regard to our foamy macrophage model, phenotypic studies show that the so-called M1 and M2 markers are actually expressed on this physiopathological model but at a rather basal level if we refer to extreme populations. We will therefore test in future flow cytometry other scavenger receptors, such as Lox1, CD36 and CD204. In parallel, we observed our model as well as the M1 and M2 in fluorescence microscopy to follow the intermediates of the metabolism; NADH and FAD. According to the literature, M1 use a metabolism based on glycolysis and little on mitochondrial respiration; they accumulate a lot more NADH than FAD and have a high NADH / FAD ratio. M2s, on the other hand, use fatty acid oxidation and mitochondrial respiration and, as a result, have a much lower NADH / ADF ratio than M1. We observed the presence of these intermediates thanks to a bi-photonic fluorescence microscope allowing a more precise measurement. Quantification validated the literature data for our M1 and M2 models. As for the foamy macrophage model, the results tend towards an even lower NADH / ADF ratio than that of M2. We wish to supplement these studies with NMR studies to study the preferentially used metabolic pathways and proteomics to establish protein expression profiles. Studies have already been done and the results are being processed. The study of their breathing is also planned, the protocol has already been validated. Immunohistochemistry (IHC) experiments were also performed to validate our markers studied in flow cytometry on sections of human atheromatous plaques. Finally, a phage-display experiment was carried out on the physiopathological model - macrophages activated by LDLoxydées + extracts of carotid plaques - in order to isolate antibodies specific for these macrophages and therefore atheromatous plaques.