qualification sur puce des sous-population de Vésucles extracellulaires triées par microfluidique

par Daniel Guneysu

Projet de thèse en Sciences pour l'Ingénieur

Sous la direction de Wilfrid Boireau et de Céline Elie-caille.

Thèses en préparation à Bourgogne Franche-Comté , dans le cadre de SPIM - Sciences Physiques pour l'Ingénieur et Microtechniques , en partenariat avec FEMTO-ST Franche Comté Electronique Mécanique Thermique et Optique - Sciences et Technologies (laboratoire) et de Micro Nano Sciences et Systèmes (MN2S) (equipe de recherche) depuis le 01-11-2017 .


  • Résumé

    Contexte du sujet de thèse Les microvésicules (EV) issues de cellules sont des vésicules de tailles nanométriques libérés sous certaines conditions physiologiques par presque toutes les cellules présentent dans le corps et qui circulent dans les différents fluides du corps. Elles sont de plus en plus étudiées, car ce sont de potentiels biomarqueurs pathologiques. L'identification et la caractérisation de vésicules de taille nanométriques, dans les fluides corporels, pourraient permettre de mener des diagnostics et des tests sur des pathologies qui n'ont encore jamais été réalisés pour un certains nombres de maladie. A cause de leurs complexités, que ce soient leurs tailles, leurs origines cellulaires ou encore les marqueurs présents sur leurs membranes, il n'existe pas de techniques idéal pour les étudier de façon complète (quantification, caractérisation, corrélation entre fonctions et structure) actuellement. En effet, toutes les techniques actuellement disponibles (Incluant la cytométrie en flux (FC), le DLS, TRPS, NTA…) ont chacune leurs limites, pour capturer l'ensemble des différentes populations de vesicules extracellulaires, que ce soit à cause de la taille des échantillons, des marqueurs membranaires, ou encore des propriétés structures/fonctions. Seule une combinaison de différentes techniques pourrait passer cette barrière et ainsi apportés l'ensemble des informations nécessaires pour évaluer les EVs. Le manque d'automatisation des méthodes et la difficulté à appliques ces méthodes pour un grand ensemble d'échantillon est également un frein. Toutes ces contraintes empêchent des progrès fondamentaux indispensables et qui permettrai de mettre en place des diagnostics pratiques plus performants. Dans ce contexte, l'objectif global du projet MADNESS est de développer un outil conceptuel miniaturisé qui combine une étape pré-analytique et une plateforme analytique permettant l'isolation, le fractionnement et la classification des EVs. Comme module pré-analytique, nous proposons une approche microfluidique couplant une séparation hydrodynamique avec des chambres d'analyses et de réactions. Le module microfluidique permettra de séparer les EVs selon leurs tailles, dans une gamme de taille allant de 100 nm à 500 nm, ce qui n'est pas possible actuellement en FC. Devant chaque chambre, nous envisageons d'interconnecter des rangées de ligand et d'anticorps miniaturisés, dans des microcanaux, comme dans notre plateforme nanobioanalytiques, afin de capturer spécifiquement les différentes espèces, dans un format multiplex permettant le suivi des espèces piégées par des investigations nanometrologiques à l'aide d'un instrument AFM. Dans un second temps, chaque échantillon fractionné, donc dépisté, sera collecté en sortie afin d'être qualifié et quantifié, ce qui permettra d'accéder au phénotype, au génotype, et d'obtenir des données métrologiques et morphologique, mais également de travailler avec des approches multi-omics, grâce à la spectrométrie de masse, disponible dans notre panel d'instrument. Bien que ce projet se concentre sur un problème d'instrumentation, une preuve de concept sera apportée à l'aide de microvésicules plaquettaires (PMVs) qui représentent la majorité des EVs. Selon le stimulus responsable de leurs productions, les PMVs exercent différentes fonctions biologiques telles que la capacité à stimuler ou pas les cellules endothéliales ou les cellules dendritiques. Ces propriétés seront utilisées afin d'avoir une lecture fonctionnelle pour analyser les échantillons fractionnés de PMVs. Cette approche multiparamétrique et multifonctionnelle va être la rampe de lancement permettant une instrumentation générique pour une qualification de nanoparticules biologiques capables d'engendrer de nouveaux diagnostics/pronostics. Notre stratégie est construite autour de deux axes principaux, incluant une preuve de concept sur les PMVs : 1) Développer une puce microfluidique multifonctionnelle afin d'isoler et de fractionner les EVs (PHD et LAAS) 2) Coupler la partie microfluidique avec la plateforme nanobioanalytique et qualifier les EVs (PHD à FEMTO-ST) Un conseil de scientifique international (en biologie et en médecine) apportera ses compétences tout au long du projet pour trouver une solution globale à différentes cibles pour les EVs et leurs applications. Objectifs du projet de thèse femto Basé sur les performances de la plateforme nanobioanalytique (couplage d'une approche SPR et AFM), récemment validé, nous envisageons la miniaturisation du dispositif et l'interfaçage entre la partie microfluidique et notre plateforme. Le but du projet est de développer un module analytique miniature capable d'immunocapture des EVs après chaque sortie de la partie microfluidique et également de collecter les différents échantillons. Les rangées d'EVs vont agir comme une phase solide d'immuno-chromatographie efficace qui, dans un second temps, seras analysé par AFM. Un des défis importants sera de dessiner, réaliser et valider les microrangés, tout en conservant les propriétés acquises avec la puce originelle. Cette étape de miniaturisation, tout en conservant les propriétés acquises du dispositif, est un objectif stratégique pour notre groupe. Les objectifs de ce sujet de thèse sont : 1) Réaliser et optimiser une puce d'or contenant des ligands en surfaces permettant de capturer les différentes espèces de façon spécifique. 2) Atteindre, dans la configuration du module NBA, les performances et la facilité d'utilisation de la plateforme NBA déjà obtenue, que ce soit en termes de biocapture et en termes de nanometrologie sur les cibles biologiques. 3) Réussir l'analyse complète sur un mix de particules biologiques correctement calibrés ou des EVs apportés par les membres du conseil scientifiques et par les intervenants industriels. Pour atteindre ce but, nous proposons un système fonctionnel complet couplant un système microfluidique permettant la séparation des particules avec une puce bioanalytique.

  • Titre traduit

    on chip qualification of a subpopulation of EVs sorted by microfluidic approach


  • Résumé

    Context of the PhD thesis Cell-derived microvesicles (EVs) are nanometer size vesicles released under physiological conditions by almost all cells present in the body and are circulating in body fluids. They are increasingly regarded as promising indicators of pathologies (i.e., biomarker). Therefore identifying and characterizing nanoscale vesicles in biofluids could lead to unprecedented diagnosis/prognosis assays for a wide set of pathologies. Due to their complexity in size, origin and membrane markers, there is currently no ideal technology available yet to quantify and characterize cell-derived microvesicles, and fully explore their structure/functions relationship. Indeed, all currently available methods (including flow-cytometry, dynamic light scattering, tunable resistive pulse sensing, nanoparticle tracking analysis, etc.) have limits in their ability to capture the whole diversity of cell microvesicle populations in terms of size, membrane markers expression, and structure/function properties. Indeed, only a combination of technologies can provide the required set of information needed for assessing EVs. In addition, current methodologies are not amenable to automation and largescale analysis of numerous samples. These issues represent serious bottlenecks, which impede fundamental progress as well as practical diagnostic breakthroughs. In that context, the overall objective of the MADNESS project is to develop a miniaturized conceptual combined preanalytical & analytical platform allowing the isolation, fractionation and classification of EVs. As the preanalytical module, we propose a microfluidic approach coupling a hydrodynamic separation module with analysis and reaction chambers. The microfluidic module will perform size fractionation within the 100-500 nm range where flow cytometers cannot operate. In front of each collecting chambers, we envision to interconnect miniaturized immuno (and ligands)-µarray in microchannels, as the nanobioanalytical module, in order to perform specific captures in a multiplex format followed by nanometrological investigation of trapped species with an AFM instrumentation. Then, each fractionated samples, thus screened, will be collected in output in order to be quantified and qualified, in terms of phenotype, metrology and morphology, but also with multi-omics approaches by coupling mass spectrometers available in our instrumental park. Although this project focusses on instrumental issues, a proof of concept will be performed on the representative case of platelet microvesicles (PMVs). Depending on the stimulus responsible for their production, PMVs exert different biological functions (i.e., capacity to stimulate or not endothelial cells, dendritic cells). This will be used as a functional read-out to analyze fractioned PMV samples. This multiparametric and multifunctional approach will pave the way to a generic instrumentation for bio-nanoparticles qualification enabling new diagnostic/prognostic assays. Our strategy is built up on 2 aims and development steps, following by a proof of concept on platelet microvesicles : 1) to develop a multifunctional microfluidic chip for microvesicle isolation and fractionation (PhD at LAAS Institute), 2) to couple the microfluidic device with a dedicated nanobioanalytical platform and perform EVs qualification (PhD at FEMTO-ST). All the project will be surrounded by an international scientific board in biological and medical fields in order to fit the global solution to various EVs targets and applications.   Objectives of the PhD FEMTO-ST thesis Based on the potential of the NanoBioAnalytical platform (combining SPR and AFM approaches), recently validated (Obeid S. et al, Biosens. & Bioelectron. 2017), we envision its miniaturization and its interfacing to the microfluidic sorter. So, the aim of this task is to develop a miniaturized analytical module enabling the immunocapture of EVs from each output of the microfluidic sorter and the sample collection. The EVs array will act as an efficient immuno-chromatographic solid-phase that will be investigated in a second step by AFM. An important challenge will be to design, realize and validate µarrays with the same properties of our classical SPR biochips. This is a strategic goal of our group to miniaturize immuno-arrays while preserving their properties and allowing their investigations by AFM. The PhD objectives are : 1) to realize and optimize a ligand-based gold-chip architecture. 2) to reach, in the configuration of the NBA module, the performances and usability of the already published NBA platform in terms of biocapture and nanometrological characterization of biological targets 3) to achieve complete analytical task on mix of well calibrated biological particles or EVs provided by the members of the scientific board and by industrial providers. To reach this goal, we propose a fully functional system coupling the microfluidic sorter with the bioanalytical chip.