Métabolisme des lipides et pathologies oculaires

par Pierre-henry Gabrielle

Projet de thèse en Médecine, biochimie, biologie cellulaire et moléculaire, physiologie et nutrition

Sous la direction de Catherine Creuzot garcher et de Niyazi Acar.

Thèses en préparation à Bourgogne Franche-Comté , dans le cadre de École doctorale Environnements, Santé (Dijon ; Besançon ; 2012-....) , en partenariat avec Procédés Alimentaires et Microbiologiques (PAM) (Dijon) (laboratoire) depuis le 02-11-2017 .


  • Résumé

    La rétine tapisse le côté interne du globe oculaire à son pôle postérieur. Son rôle est primordial puisqu'elle est le tissu neurosensoriel de l'œil permettant la transduction visuelle, c'est-à-dire la transformation de l'information lumineuse en influx nerveux. Anatomiquement, la rétine regroupe la neuro-rétine et l'épithélium pigmentaire de la rétine (EPR) reposant sur la membrane de Bruch (MBr). Au-delà du voisinage physique de la neurorétine et de l'EPR, leurs liens métaboliques sont cruciaux pour le fonctionnement de la neurorétine. La rétine neurosensorielle est riche en lipides : 25% de sa matière sèche, répartie entre 90% de phospholipides et 10% de cholestérol (Bretillon et al., 2008). Le cholestérol est le principal stérol de la rétine des vertébrés (Fliesler et Schroepfer, 1982). Le cholestérol est exclusivement présent sous forme libre dans la rétine neurosensorielle (Bretillon et al., 2008). Les dépôts de cholestérol libre et d'esters de cholestérol entre l'EPR et la MBr au sein de drusen sont caractéristiques aussi bien du vieillissement chez l'homme, que dans la Dégénérescence Maculaire Liée à l'Âge (DMLA). Les drusens sont des dépôts extracellulaires entre le RPE et la MBr. Le vieillissement est le facteur de risque prédominant dans le développement de la DMLA, principale cause de perte de vision après l'âge de 50 ans dans les populations occidentales (Klein et al. 2005). Le système de classification des maculopathies liées à l'âge de la WISCONSIN Study (Klein et al. 1991, Varma et al. 2010) reste l'échelle de notation la plus utilisée et la plus reconnue par les ophtalmologistes. En utilisant cette échelle, les stades précoces de la maladie sont appelés maculopathie liée à l'âge (MLA) et correspondent à la présence de drusen séreux confluent ou non confluent, ou de drusen réticulé (ou pseudo-drusens réticulé, PDR), avec hyperpigmentation ou hypopigmentation. D'autres facteurs de risque comme le terrain génétique et certains facteurs environnementaux ont été identifiés pour la DMLA. Parmi eux, l'alimentation, et plus particulièrement l'apport en certains lipides et molécules lipophiles (en particulier les acides gras polyinsaturés et caroténoïdes) et minéraux a été montré comme étant protecteur contre la survenue de la MLA et son évolution en DMLA (Seddon et al. 2003 et 2011). Malgré quelques études, il n'existe pas de consensus pour d'autres nutriments comme la vitamine D ou les vitamines B ou encore l'homocystéine (Morrison et al. 2011, Nowak et al. 2005) Le but de ce projet de thèse est de vérifier l'implication du dysfonctionnement de l'homéostasie lipidique dans la physiopathogénie de la DMLA. La première partie du projet aura pour but de mettre en évidence l'association présumée de plusieurs molécules lipophiles dans la physio-pathogénie de la DMLA. En effet, plusieurs études concernant le dysfonctionnement du métabolisme des vitamines B6, B12, D et l'homocystéine auraient rapportés un risque accru de DMLA. Devant la présence d'études contradictoires sur le sujet, il serait donc intéressant d'apporter plus d'informations sur le sujet. Pour cela, nous bénéficions de la cohorte MONTRACHET, regroupant un total de 1153 sujets de plus de 75 ans et ayant bénéficié d'un examen ophtalmologique et clinique général complet associé à des questionnaires et une prise de sang. L'objectif est de comparer le taux plasmatique de ces différentes molécules entre les sujets présentant une DMLA avancée vs les sujets avec MLA vs les sujets sans MLA. La deuxième partie du projet sera dédiée à la compréhension des mécanismes lipides-dépendants impliqués dans l'altération de l'EPR et l'apparition des dépots drusénoides dans la DMLA. Les Drusens contiennent les facteurs H, B, -I, -C3, -C5 et -C9 du complément, en plus de la vitronectine, de la clustérine, de la bêta-amyloïde, de la lipofuscine, de la protéine C-réactive, des produits finaux de glycation avancée, du cholestérol et les esters de cholestérol (Anderson et al., 2010). L'origine des drusens est en partie incertaine, mais un faisceau d'arguments suggère que la perte partielle de la fonction de l'EPR participe à leur dépôt. En effet, l'EPR a une double fonction. Il remodèle d'abord les lipoprotéines provenant de la choroïde, et fournit donc des nutriments aux photorécepteurs. Deuxièmement, l'EPR élimine les débris générés par la rétine à la choroïde vasculaire. Il est largement reconnu que ces processus deviennent moins efficaces avec l'âge avancé, conduisant à des déficiences du RPE et de la rétine. Un type de lésion drusénoide, nommé le pseudo-drusen réticulé (PDR), est particulièrement intéressante. Les PDR ont été décrits pour la première fois en 1990 par le service d'ophtalmologie de Creteil (Soubrane et al., 1991 ; Mimoun et al., 1990) et identifiés comme des lésions jaunâtres, indistinctes, profondes et typiquement situées le long des arcades vasculaires supérieures. Le système de classification de la maculopathie liée à l'âge de la WISCONSIN study a classé le PDR en tant qu'entité séparée (Klein et al., 1991). De nombreuses études ont montré que la présence de PDR est associée à une probabilité plus élevée de développer une DMLA tardive sous forme d'atrophie géographique (Klein et al., 2008 ; Schmitz-Valckenberg et al., 2011 ; Xu et al., 2013). De plus, les nouvelles méthodes d'imagerie, telles que la tomographie par cohérence optique du domaine spectral (SD-OCT), ont montré que les PRD étaient en fait des dépôts drusénoides sous-rétiniens (Zweifel et al., 2011) à contrario des drusens séreux se situant entre l'EPR et la MBr, améliorant ainsi leur diagnostic (Querques et al., 2012). Les mécanismes physiopathologiques proposées sont divers et incertains mais l'équipe de Curcio et al. (2013) propose une théorie liée à une altération de l'homéostasie du cholestérol et du transfert des lipides au sein des photorécepteurs et des cellules de l'EPR. Récemment, dans une étude lipidomique de Lains et al. (2017) réalisée sur du plasma prélevé chez des sujets présentant un DMLA a été montré le rôle probable d'altérations du métabolisme glycérophospholipides chez les sujets atteints de DMLA. Sur la base de ces données et dans le but de mieux comprendre la physiopathologie de la DMLA, et plus particulièrement les mécanismes qui conduisent à l'accumulation de PDR, nous proposons de réaliser des études similaires chez les sujets concernés de la cohorte MONTRACHET. Les données de la première partie permettront également de vérifier l'implication des métabolismes des vitamines B6, B12 et de l'homocystéine dans la formation des PDR. Pour mener à bien ce projet, nous comparerons les profils lipidomiques du plasma sanguin des patients présentant une MLA avec PDR vs des patients MLA avec drusens séreux ou des patients témoins sans MLA. Afin de mettre en lumière les mécanismes sous-jacents, nous travaillerons sur une lignée de cellule d'EPR (lignée ARPE19) qui sera traitée, soit avec du sérum des patients présentant des PDR, soit directement avec les espèces lipidiques discriminées lors de l'analyse lipidomique. Les altérations du métabolisme cellulaire (viabilité, accumulation de lipofuscine, pigmentation, modification du métabolisme lipidique et protéique) ainsi que les voies cellulaires et moléculaires les gouvernant seront étudiées en réponse aux traitements. La dernière partie du projet sera centrée sur l'implication potentielle de l'endotoxémie (exposition au lipopolysaccharide ou LPS) dans la physiopathogénie de la DMLA. Le LPS est un composant essentiel de la face externe de la membrane externe des bactéries à gram négative. C'est une endotoxine ou « pathogen-associated molecular pattern » qui a la capacité de faire réagir le système immunitaire pour entraîner une réaction inflammatoire. Elle est composée de 3 parties : un antigène O qui est une chaine osidique, un cœur oligosaccharidique et un lipide A hydrophobe lui permettant son ancrage à la membrane externe. La composition en chaine acide gras détermine sa propriété toxique. Le LPS se lie au récepteur Toll Like Receptor (TLR) 4 et promeut la libération de cytokines pro-inflammatoires par l'activation de protéines adaptatrices comme MYD88. La rétine et en particulier l'EPR expriment la plupart des membres de la famille des TLR (Kumar V et al. 2004). La contribution de la voie des TLR dans la DMLA est en cours d'intense investigation. Des études rapportent l'association d'un polymorphisme de TLR3 (Yang et al., 2008) et TLR4 (Zareparsi et al., 2005) avec la DMLA. Toujours dans le cadre de l'étude MONTRACHET, nous comparerons la composition en LPS du sérum des patients présentant une DMLA versus des patients sans DMLA. Nous pourrons également caractériser le type de LPS associé à la DMLA (en particulier la nature du lipide A). L'étude des mécanismes sous-jacents sera abordée conjointement avec celle de la seconde partie du projet par exposition des cellules au même type de LPS identifié lors de l'étude clinique. Par sa double approche, à la fois clinique et mécanistique, ce projet devrait permettre de confirmer/infirmer l'implication du métabolisme de molécules lipophiles dans la pathogénie de la DMLA en général, et de la forme avec PDR en particulier. Il devrait également permettre d'apporter des éléments sur les mécanismes sous-jacents impliqués au sein des cellules de l'EPR.

  • Titre traduit

    Lipid metabolism and ocular diseases 


  • Résumé

    The retina covers the internal side of the ocular globe at its posterior pole. The primary and fundamental function of the retina is to convert light into an electrical signal, also called photo-transduction. The retina is composed of the neurosensory retina and the retinal pigment epithelium (RPE) that lied on the Bruch's membrane (BrM). Beyond their physical vicinity, their metabolic links are crucial for the functioning of the retina. The neurosensory retina is rich in lipids: 25% of the dry mater, partitioned between 90% phospholipids and 10% cholesterol (Bretillon et al., 2008b). Cholesterol is the main sterol in the vertebrate retina (Fliesler and Schroepfer, 1982). Cholesterol is exclusively present as the form in the neurosensory retina (Bretillon et al., 2008b). Deposits of free cholesterol and cholesterol esters between RPE and BrM within drusen are characteristic of both aging in humans and Age-related Macular Degeneration (AMD). Drusens are extracellular deposits between RPE and BrM. Aging is the prominent risk factor for the development of AMD, the leading cause of visual loss after the age of 50 years in western populations (Klein et al. 2005). The age-related maculopathy (ARM) classification system of the WISCONSIN Study (Klein et al 1991, Varma et al., 2010) remains the most widely used and recognized rating scale. Using this scale, the early stages of the disease are called age-related maculopathy (ALM) and correspond to the presence of distinct or indistinct serous drusen, or reticular drusen (or RD), with hyperpigmentation or hypopigmentation. Other risk factors such as genetic background and environmental factors have been identified for AMD. Among them, diet and more particularly the contribution of lipids and lipophilic molecules (in particular polyunsaturated fatty acids and carotenoids), and minerals has been shown to be protective against the occurrence of ARM and its evolution to ARMD (Seddon et al., 2003 and 2011). Despite some studies, there is no consensus for other nutrients such as vitamin D or vitamins B or homocysteine ​​ (Morrison et al 2011, Nowak et al., 2005). The aim of this thesis project is to clarify the involvement of lipid homeostasis dysfunction in the pathogenesis of AMD. The first part of the project will aim to highlight the presumed association of several lipophilic molecules in the physio-pathogenesis of AMD. Indeed, several studies reported an increased risk of AMD in relation to the metabolic dysfunction of vitamins B6, B12, D and homocysteine ​​. Given the presence of conflicting studies on the subject, it would be interesting to bring more information on the subject. To this end, we benefit from the MONTRACHET cohort, comprising a total of 1153 subjects over 75 years old, who underwent a complete ophthalmological and general examination combined with questionnaires and blood samples. The objective is to compare the plasma level of these different molecules between subjects with AMD vs subjects with ARM vs subjects without ARM. The second part of the project will focus on understanding the lipid-dependent mechanisms involved in the alteration of RPE and the appearance of drusenoid depostis in AMD. Drusens contain complement factors H, B, -I, -C3, -C5 and -C9, in addition to vitronectin, clusterin, beta-amyloid, lipofuscin, C-reactive protein, advanced glycation end products, cholesterol and cholesterol esters (Anderson et al., 2010). The origin of the Drusen is partly uncertain, but a bundle of arguments suggests that the partial loss of the function of the RPE participates in their appearence. The RPE has a dual function. It first remodels the lipoproteins from the choroid, and thus provides nutrients to the photoreceptors. Secondly, the RPE eliminates the debris generated by the retina. It is widely recognized that these processes become less effective with older age, leading to the dysfunction of RPE and neuroretina. One type of drusenoid lesion, called the reticular drusen (RD) is particularly interesting. The RD were first described in 1990 by Creteil's ophthalmology department (Soubrane et al., 1991, Mimoun et al., 1990) and identified as yellowish, indistinct, deep lesions typically located along the upper temporal vascular arch. The age-related maculopathy classification system of the WISCONSIN study has classified the RD as a distinct lesion (Klein et al., 1991). Numerous studies have shown that the presence of RD is associated with a higher probability of developing late AMD, particularly geographic atrophy (Klein et al., 2008, Schmitz-Valckenberg et al., 2011, Xu et al. 2013). In addition, new imaging methods, such as Spectral Domain Optical Coherence Tomography (SD-OCT), have shown that RD is subretinal drusenoid deposit (Zweifel et al., 2011) in contrast with serous drusen which lies between RPE and BrM, thus improving their diagnosis (Querques et al., 2012). The pathophysiological mechanisms proposed are diverse and uncertain, but Curcio et al. (2013) proposes a theory related to an alteration of cholesterol homeostasis and lipid transfer in photoreceptors and RPE cells. Recently, in a lipidomic study of Lains et al. (2017) performed on plasma sample of subjects presenting AMD, it has been shown the possible dysfunction of glycerophospholipid metabolism in subjects with AMD. On the basis of these data, and to better understand the pathogenesis of AMD and more particularly the mechanisms that lead to the accumulation of RD, we propose to carry out a similar analysis on the subjects of the MONTRACHET cohort. The data in the first part will also clarify the involvement of vitamins B6, B12 and homocysteine metabolism ​​in the formation of RD. To carry out this project, we will compare the lipidomic profile of ARM patients with RD vs ARM patients with serous drusens vs control patients without ARM. To highlight the underlying mechanisms, we will work on RPE cell line culture (line ARPE19) that will be treated, either with serum of patients with PDR, or directly with the lipid species discriminated by the lipidomic analysis. Alterations in cell metabolism (viability, lipofuscin accumulation, pigmentation, lipid and protein metabolism modification) and the cellular and molecular pathways involved will be studied. The final part of the project will focus on the potential involvement of endotoxemia (exposure to lipopolysaccharide or LPS) in the pathophysiology of AMD. LPS is an essential component of the outer surface of the gram-negative bacteria membrane. It is an endotoxin or "pathogen-associated molecular pattern" that has the ability to react with the immune system to cause an inflammatory reaction. It is composed of 3 parts: An O antigen which is an osidic chain, an oligosaccharide core and a hydrophobic lipid A allowing it to be anchored to the outer membrane. The fatty acid chain composition determines its toxic property. LPS binds to the Toll Like Receptor (TLR) 4 and promotes the release of pro-inflammatory cytokines through the activation of adaptor proteins such as MYD88. The retina and the RPE express most members of the TLR family (Kumar V et al., 2004). The contribution of the TLR pathway in AMD is under intense investigation. Studies report the association of TLR3 (Yang et al., 2008) and TLR4 polymorphism (Zareparsi et al., 2005) with AMD. Also in the context of the MONTRACHET study, we will compare the LPS composition of the serum of patients with AMD versus patients without AMD. We will also be able to characterize the type of LPS associated with AMD (in particular the nature of lipid A). The study of the underlying mechanisms will be discussed in conjunction with the second part of the project by exposing RPE cell culture to the same type of LPS discriminated in the clinical study. By its dual approach, both clinical and mechanistic, this project should permit to confirm/refute the implication of the lipophilic molecules metabolism in the pathogenesis of AMD in general, and to the formation of RD. it should also provide information on the underlying mechanisms involved within the cells of the RPE.