Prévalence et caractérisation des souches de Toxoplasma gondii, Giardia duodenalis et Cryptosporidium spp. dans l'eau et les aliments de la région de Marrakech, Maroc

par Salma Berrouch

Projet de thèse en Médecine

Sous la direction de Isabelle Villena.

Thèses en préparation à Reims en cotutelle avec l'Université Cadi Ayyad , dans le cadre de Sciences Fondamentales - Santé , en partenariat avec (PTA) Protozooses Transmises par l'Alimentation (cryptosporidiose, giardose et toxoplasmose) : mode de contamination et pathogénie) PROTAL (laboratoire) depuis le 01-11-2017 .


  • Résumé

    1-Présentation du sujet Comme d'autres populations, celle de la région de Marrakech est confrontée aux problèmes de santé publique d'origine hydrique et alimentaire, liés à la présence des polluants biologiques (parasites ,bactéries, virus) causant diverses infections (Cryptosporidiose, Choléra, Typhoïde, Giardiase, Hépatites, Méningites, Gastro-entérites, ….etc). La contamination de l'homme par ces polluants serait directement ou indirectement imputée à la consommation des eaux de distribution, de surface (sources, rivières, barrages..) ou souterraines (puits), et / ou d'aliments contaminés. Ce phénomène serait en nette progression vu que les activités touristiques et industrielles ne cessent de croître dans cette région du Maroc. Les risques de contamination sont d'autant plus importants que les règles d'hygiène sont peu ou non respectées. Les objectifs de ce sujet sont : ✓ Réaliser une étude prospective et analytique afin de rechercher et d'identifier Toxoplasma gondii, Giardia duodenalis et Cryptosporidium spp dans les sources d'approvisionnement en eau de consommation (robinet, puits et sources) et dans les aliments issus de la région de Marrakech, ceci pendant les quatre saisons de l'année et sur une durée de 2 ans ; ✓ Comparer les espèces parasitaires détectées et identifiées sur le plan moléculaire aux espèces retrouvées par d'autres équipes marocaines et françaises; ✓ Evaluer l'impact sanitaire des espèces retrouvées ; 2-Déroulement de la thèse Mes travaux de recherche ont débuté par une synthèse bibliographique des études qui ont été déjà réalisées par les autres équipes, ceci afin de situer la problématique et de dégager les objectifs quant à la mise en évidence des parasites tels que Cryptosporidium, Giardia, et Toxoplasma dans les eaux et les légumes destinés à la consommation humaine. Cette synthèse bibliographique sera mise à la disposition du comité scientifique sous forme d'un article qui est en cours de réalisation. Durant les trois années de thèse en co-tutelle, les travaux seront axés sur la recherche, l'identification, la prévalence et le génotypage des souches des trois protozoaires pathogènes pour l'homme et l'animal dans la région de Marrakech. Cette recherche sera réalisée au niveau des eaux de consommation, certains végétaux poussant à ras du sol et consommés crus. 2-1.Recherche dans les eaux de consommation : Les prélèvements seront réalisés au niveau du réseau de distribution de l'eau de la ville de Marrakech et dans des puits et sources de deux zones rurales de la région de Marrakech, selon la topologie suivante :Tnine d'Ourika (région montagneuse), et Souihla (région de la plaine). Les prélèvements de 40 litres seront effectués dans différentes sources d'approvisionnement (20 prélèvements par région et par saison, dont 10 au niveau des sources et 10 au niveau des puits), au cours des 4 saisons de l'année et ce pendant 2 ans. Cela représentera une collecte de 80 prélèvements par région et par an, soit un total de 320 prélèvements pour l'ensemble de la période de l'étude. Les échantillons seront filtrés à travers des membranes de 1µm afin de retenir les kystes et les oocystes des parasites. Les filtres seront lavés en sens inverse à l'eau physiologique additionnée de tween 80 pour récupérer les matières particulaires. Nous procéderons par la suite à la séparation (immuno-magnétique et/ou centrifugation) puis à la recherche des parasites par : - Examen microscopique en immunofluorescence et PCR en temps réel pour les oocystes de Crptosporidium spp; - Examen microscopique en immunofluorescence et PCR en temps réel pour les kystes de Giardia duodenalis ; - PCR en temps réel pour les oocystes de Toxoplasma gondii ; L'étude de la viabilité sera également réalisée si des parasites sont isolés. N.B : La phase d'amplification génique par PCR en temps réel sera précédée par une phase de préextraction de l'ADN au cours de laquelle la rupture de la paroi des parasites sera obtenue par des chocs thermiques et mécaniques, puis une phase d'extraction d'ADN (transfert technologique par le Laboratoire de Reims). 2-2. Recherche dans les Végétaux : La recherche des parasites sera réalisée au niveau de certains végétaux régulièrement consommés dans la région d'étude tels que : la laitue, les carottes et la coriandre. Les végétaux seront achetés pendant 2 ans à raison d'une fois par semaine dans 3 marchés situés dans la ville de Marrakech, à Tnine d'Ourika (région montagneuses), et Souihla (région de la plaine) tout en notant les moyens et les sources d'irrigation. Les végétaux seront transportés au laboratoire et traités (lavage en tampon glycine notamment). Le culot obtenu après traitement fera l'objet de recherche des formes parasitaires par : - Examen microscopique en immunofluorescence et PCR en temps réel pour les oocystes de Cryptosporidium spp ; - Examen microscopique en immunofluorescence et PCR en temps réel pour les kystes de Giardia duodenalis ; - Examen microscopique (autofluorescence des oocystes) et PCR en temps réel pour les oocystes de T. gondii ; L'étude de la viabilité sera également réalisée si des parasites sont isolés. N.B : La phase d'amplification génique par PCR en temps réel sera précédée par une phase de préextraction de l'ADN au cours de laquelle la rupture de la paroi des parasites sera obtenue par des chocs thermiques et mécaniques, puis une phase d'extraction d'ADN (transfert technologique par le Laboratoire de Reims).

  • Titre traduit

    Prevalence and caracterisation of Toxoplasma gondii, Giardia duodenalis species and Cryptosporidium spp. in drinking water and fresh vegetables consumed in Marrakesh, Morocco


  • Résumé

    1. Presentation As some bacteria and virus, parasites are an important problem at the present, which is the contamination of drinking water and food. Various studies have been done in many countries and showed that the contamination of water occurred mainly because of the insufficiency of water treatment, luck of the good hygiene practices and the environmental pollution. Vegetables can also be contaminated along the process of planting to consumption. The transmission of parasites to humans can happen through unintentional consumption of contaminated water or food, and infections (i.e giardiasis and cryptosporidiosis). The most frequent parasite formes detected in drinking water and food are (Oo)cysts of Giardia spp, Cryptosporidium spp, and Toxoplasma gondii. Various methods are used to reduce parasite contamination in water resources. Such as free chlorination, which is effective and safe at low dosages, however, it could not completely eliminate waterborne parasites, especially Giardia and Cryptosporidium because of their resistance. The aim of our study is to: ✓ To Realize a prospective and analytical study to detect and identify the various parasites found in water supplies and fresh vegetables in the region of Marrakesh, during 2 years ; ✓ Compare the parasitic species detected and identified on a molecular level with the species found in other researches; ✓ Estimate the sanitary impact of the found species; 2. Planning of thesis work : A review that highlights most of researches carried on drinking water, fruits, and vegetables, particularly the techniques adopted for detection, concentration and identification of parasites, and the results of each research, will be published as an article, which is in progress. During the 3 years of the exchange thesis programm, the thesis work will focus on the detection of Cryptosporidium spp., Giardia duodenalis and Toxoplasma gondii, their identification and prevalence in the region of Marrakesh. The species of these three pathogens will be also determined by genotyping. The study will be carried on drinking water supplies and fresh vegetables consumed raw in Marrakesh. 2.1. Detection of parasites in drinking water: Water samples will be collected from different points: - The supply sources of treated drinking water in Marrakesh; - Well and spring water from two rural areas of different topologies: Tnin Ourika (mountainous region), and Souihla (plan area), in the region of Marrakesh. Samples of 40l will be collected from different supply sources (20 samples per region and per season), including 10 well water samples and 10 spring water samples. The collected waters samples will be filtered through a nitrocellulose membrane (1µm pore size). (oo)cysts and/or ova trapped on the surface of the filter will be collected in a solution of tween 80, and isolated from other particulate material by immunomagnetic separation and/or centrifugation. Samples will be examined by immunofluorescence microscopy and PCR technique, for the detection of Cryptosporidium oocysts, Giardia cycts and Toxoplasma oocysts. The viability of the detected parasites will be also tested. N.B: The PCR amplification will be preceded by the pre-extraction of the DNA by removing the parasitic membrane using thermal and mecanical shocks, then the DNA extraction. 2.3. Detection of parasites in fresh vegetables : The study vegetables will includ lettuce, coriander and carrots that are commonly consumed in Marrakesh. These vegetables will be purchashed from 3 different markets in Marrakesh: Tnin Ourika (mountainous region), and Souihla (plan area), during two years. Samples will be transported to the laboratory and analyzed as followed: Washing with Glycine buffer and concentration by centrifugation, the pellet will be examined for parasites by immunofluorescence microscopy and PCR technique. The viability of the detected parasites will be also tested. N.B: The PCR amplification will be preceded by the pre-extraction of the DNA by removing the parasitic membrane using thermal and mecanical shocks, then the DNA extraction.