Des cellules satellites aux atlas tissulaires: nouvelles méthodes pour détecter et prévenir le stress induit par la dissociation

par Léo Machado

Thèse de doctorat en Biologie cellulaire et moléculaire

Sous la direction de Frederic Relaix et de Philippos Mourikis.

Thèses en préparation à Paris Est , dans le cadre de Ecole doctorale Sciences de la Vie et de la Santé , en partenariat avec Institut Mondor de Recherche Biomédicale (Créteil) (laboratoire) .


  • Résumé

    Chaque cellule d'un organisme multicellulaire interagit dynamiquement avec son microenvironnement, ce dernier étant un régulateur majeur de ses fonctions et de son profil d'expression génique. Cependant, la plupart des analyses moléculaires à haut débit modernes comme le séquençage d'ARN nécessitent l'isolation des cellules de leur microenvironnement. Ces procédures d'isolation sont souvent un ordre de grandeur plus longues que le temps qu'il faut à une cellule pour altérer son état moléculaire - tel que son profil d'expression génique – en réponse à un stimulus. Nous avons développé une nouvelle procédure utilisant la fixation par aldéhyde pour préserver le transcriptome in vivo de cellules isolées. En utilisant les cellules souches du muscle strié squelettique (MuSCs), nous avons démontré que lors de la dissociation, ces dernières subissent des modifications transcriptionnelles d'une ampleur inattendue qui initient une transition de leur état cellulaire de la quiescence vers l'activation. De plus, nous avons découvert que l'entrée du cycle cellulaire des MuSCs est médiée par la signalisation MAPK ERK1/2 et découplée de la différenciation des MuSCs, qui nécessite l'extinction de la voie de signalisation Notch. Nous avons également confirmé par des stratégies complémentaires de cinétique temporelle que les MuSCs initient une réponse transcriptionnelle inchangée face à différents stimuli. En effet, les signatures de dissociation ex vivo et d'activation in vivo observées sont très similaires, même en séquençage de cellule unique. Pour étudier l'omniprésence d'une telle réponse à la dissociation, nous avons utilisé le séquençage d'ARN de noyau unique pour générer des atlas cellulaires à partir de muscle strié strié squelettique et de foie - intacts et dissociés - et avons trouvé, conformément aux MuSCs, de fortes et ubiquitaires modifications transcriptionnelles, au niveau cellulaire et tissulaire. La plupart des modifications étaient spécifiques pour chaque type cellulaire, mais nous avons cependant pu définir une signature de dissociation commune qui révèle un degré élevé de distorsion dans les jeux de données publiés dans la littérature, d'une manière corrélée au temps de dissociation de ladite cellule ou dudit tissu. Dans l'ensemble, notre étude propose ainsi que, pendant l'isolation, les cellules exécutent des programmes génétiques spécialisés qui entraînent des modifications de leur état cellulaire. Par conséquent, en utilisant des cellules isolées par des méthodes conventionnelles, les événements initiateurs des transitions d'état cellulaires, tels que la sortie de quiescence, sont ignorés et les jeux de données transcriptomiques de référence, comme les atlas cellulaires, sont fondamentalement déformés.

  • Titre traduit

    From skeletal muscle stem cells to tissue atlases: new tools to investigate and circumvent dissociation-induced stress


  • Résumé

    Chaque cellule d'un organisme multicellulaire interagit dynamiquement avec son microenvironnement, ce dernier étant un régulateur majeur de ses fonctions et de son profil d'expression génique. Cependant, la plupart des analyses moléculaires à haut débit modernes comme le séquençage d'ARN nécessitent l'isolation des cellules de leur microenvironnement. Ces procédures d'isolation sont souvent un ordre de grandeur plus longues que le temps qu'il faut à une cellule pour altérer son état moléculaire - tel que son profil d'expression génique – en réponse à un stimulus. Nous avons développé une nouvelle procédure utilisant la fixation par aldéhyde pour préserver le transcriptome in vivo de cellules isolées. En utilisant les cellules souches du muscle strié squelettique (MuSCs), nous avons démontré que lors de la dissociation, ces dernières subissent des modifications transcriptionnelles d'une ampleur inattendue qui initient une transition de leur état cellulaire de la quiescence vers l'activation. De plus, nous avons découvert que l'entrée du cycle cellulaire des MuSCs est médiée par la signalisation MAPK ERK1/2 et découplée de la différenciation des MuSCs, qui nécessite l'extinction de la voie de signalisation Notch. Nous avons également confirmé par des stratégies complémentaires de cinétique temporelle que les MuSCs initient une réponse transcriptionnelle inchangée face à différents stimuli. En effet, les signatures de dissociation ex vivo et d'activation in vivo observées sont très similaires, même en séquençage de cellule unique. Pour étudier l'omniprésence d'une telle réponse à la dissociation, nous avons utilisé le séquençage d'ARN de noyau unique pour générer des atlas cellulaires à partir de muscle strié strié squelettique et de foie - intacts et dissociés - et avons trouvé, conformément aux MuSCs, de fortes et ubiquitaires modifications transcriptionnelles, au niveau cellulaire et tissulaire. La plupart des modifications étaient spécifiques pour chaque type cellulaire, mais nous avons cependant pu définir une signature de dissociation commune qui révèle un degré élevé de distorsion dans les jeux de données publiés dans la littérature, d'une manière corrélée au temps de dissociation de ladite cellule ou dudit tissu. Dans l'ensemble, notre étude propose ainsi que, pendant l'isolation, les cellules exécutent des programmes génétiques spécialisés qui entraînent des modifications de leur état cellulaire. Par conséquent, en utilisant des cellules isolées par des méthodes conventionnelles, les événements initiateurs des transitions d'état cellulaires, tels que la sortie de quiescence, sont ignorés et les jeux de données transcriptomiques de référence, comme les atlas cellulaires, sont fondamentalement déformés.