Dialogue moléculaire dans l'établissement de la symbiose rhizobienne : recherche de canaux ioniques participant aux signaux électriques et calciques dans le poil absorbant de Medicago truncatula

par Julien Thouin

Projet de thèse en Biologie du développement

Sous la direction de Hervé Sentenac.

Thèses en préparation à Montpellier, SupAgro , dans le cadre de GAIA - Biodiversité, Agriculture, Alimentation, Environnement, Terre, Eau , en partenariat avec BPMP - Biochimie et Physiologie Moléculaire des Plantes (laboratoire) depuis le 01-10-2015 .


  • Résumé

    Contexte scientifique La symbiose Légumineuse-Rhizobium permet l'assimilation de l'azote atmosphérique. Elle présente de ce fait un intérêt agronomique et écologique majeur, permettant de limiter l'apport d'engrais azotés (Oldroy et Downie, 2008). Les poils absorbants jouent un rôle déterminant dans l'établissement de l'interaction de la plante avec ses microsymbiotes. L'émission de facteurs NOD par les bactéries partenaires permet au poil absorbant de percevoir la présence de ces bactéries. L'infection est initiée par l'adhésion des bactéries au poil et une réorientation de la croissance apicale de cette cellule, conduisant à la formation d'une 'crosse de berger', qui constitue le point d'infection à partir duquel un cordon d'infection est initié, par invagination de la membrane plasmique de la cellule du poil absorbant (Oldroy et Downie, 2008). Les évènements de signalisation plante-bactérie qui ont été identifiés à ce jour comme les plus précoces, déclenchés immédiatement après la perception des facteurs NOD, se traduisent par des échanges rapides d'anions et de cations (Ca2+, K+, H+) entre le poil absorbant et le milieu extérieur, conduisant à un signal électrique (dépolarisation transitoire de la membrane cellulaire) et à un signal calcique (Felle et al., 1998 ; Felle et al., 1999 ; Cárdenas et al., 1999; Kurkdjian et al., 2000). L'activation de canaux anioniques, se traduisant par un efflux d'anions, serait à l'origine de la dépolarisation de la membrane, qui activerait des canaux perméables à Ca2+, responsables d'un influx de calcium à l'origine du signal calcique. Des canaux potassiques permettant un efflux de K+ s'activeraient en réponse à la dépolarisation membranaire, entraînant une repolarisation de la membrane cellulaire. Le sujet de thèse s'inscrit dans un projet initié par l'équipe d'accueil, qui vise à obtenir une vision d'ensemble de l'implication des canaux ioniques de la membrane plasmique du poil absorbant et de leur régulation lors de l'interaction entre la légumineuse modèle Medicago truncatula, dont le séquençage du génome est achevé, et son symbiote Sinorhizobium meliloti. L'équipe a récemment conduit une approche de 'séquençage massif' des transcrits exprimés dans le poil absorbant de Medicago truncatula avant et après (4 h ou 20 h) la perception des facteurs NOD. Elle a ainsi pu déterminer le répertoire des canaux ioniques potentiels exprimés dans cette cellule. Elle a simultanément développé un système de dissection laser de la paroi du poil absorbant permettant d'avoir directement accès à la membrane cellulaire et de caractériser ainsi les canaux ioniques actifs sur cette membrane par patch clamp. L'ensemble de ce travail a permis l'identification d'un canal d'efflux de K+, appartenant à la famille Shaker, exprimé dans le poil absorbant, actif sur la membrane cellulaire et régulé en réponse aux facteurs NOD. Nous voulons maintenant utiliser les connaissances que nous avons acquises (par 'deep sequencing') et les outils que nous avons développés ('dissection laser/patch clamp') au cours de ce travail, pour identifier sur le plan moléculaire et caractériser sur le plan fonctionnel les canaux calciques de la membrane du poil absorbant. Le choix de cet objectif est motivé par deux raisons fondamentales: (i) d'une part, parce que la signalisation calcique joue un rôle majeur dans l'interaction rhizobium-poil absorbant, mais qui est encore très peu compris (Wais et al., 2000; Walker et al., 2000; Oldroy et Downie, 2008; Charpentier et al., 2008), (ii) d'autre part parce que, de façon très générale, l'état des connaissances sur l'identité moléculaire des canaux calciques chez les plantes est encore très insuffisant, et que progresser dans cette direction présente un intérêt considérable en biologie végétale de façon générale, par exemple dans le contrôle de la croissance polarisée des cellules telles le poil absorbant ou le tube pollinique (Véry & Davies, 2000; Foreman et al., 2003; Michard et al., 2009), ou dans le contrôle de l'ouverture stomatique (Wang et al. 2013)). Programme de recherche L'hypothèse consensuelle à ce jour est que les canaux calciques sont très probablement codés par deux familles multigéniques, appelées CNGC (Cyclic Nucleotide Gated Channels) et GLR (GLutamate Receptor-like) (White et al., 2002). Ces 2 familles comportent respectivement 22 et 18 membres chez M. truncatula. Les données que nous avons obtenues par 'deep sequencing' du transcriptome du poil absorbant de M. truncatula identifient essentiellement 4 gènes CNGC et 3 gènes GLR comme exprimés dans ces cellules. De plus, un de ces 4 gènes CNGC et un de ces 3 gènes GLR sont beaucoup plus exprimés que les autres. Le travail de thèse aura pour objectif d'analyser la fonction de cet ensemble de 7 gènes, en donnant la priorité chronologiquement, aux deux gènes les plus exprimés. La démarche reposera sur la caractérisation de plantes mutantes perte de fonction. De façon simplifiée, les différentes étapes du projet seront: 1) Obtention des lignées mutantes perte de fonction pour les 2 gènes prioritaires, puis pour les 5 autres gènes, à partir des collections internationales de mutants. Génotypage pour obtenir des lignées homozygotes. Vérification de l'absence de transcrit dans la plante (perte de fonction) 2) Biologie cellulaire: localisation subcellulaire des canaux CNGC et GLR cibles: vérification de leur présence sur la membrane plasmique à l'aide de fusions avec la protéine fluorescente GFP; conséquences d'une co-expression de plusieurs membres de la même famille (CNGC ou GLR) sur la localisation subcellulaire (parce que ces canaux peuvent avoir une structure hétérotétramérique) 3) Imagerie calcique: conséquences des mutations 'perte de fonction' sur la signalisation calcique dans le poil absorbant en réponse aux facteurs NOD. Analyse comparative des plantes de génotype sauvage ou mutant. 4) Electrophysiologie des canaux calciques sur la membrane du poil absorbant en réponse aux facteurs NOD. Analyse comparative des plantes de génotype sauvage ou mutant. 5) Phénotypage des plantes mutantes: analyse de leur capacité à établir une relation symbiotique avec les bactéries fixatrices (analyse de la déformation des poils absorbants après traitement par des facteurs NOD, nombre de nodules par plante...). Conclusion: intérêt du projet et formation pour l'étudiant Au niveau fondamental, ce programme concerne de façon générale les mécanismes de signalisation calcique dans les interactions symbiotiques pante-bactérie fixatrice d'azote. Ce programme fournit aussi un angle d'attaque original pour identifier au niveau moléculaire et fonctionnel in situ des canaux ioniques impliqués dans la signalisation calcique chez les plantes, un domaine dans lequel les connaissances actuelles sont encore relativement réduites et débattues. Au niveau de la formation du doctorant, le programme de Thèse lui permettra d'acquérir une expérience en biologie intégrative des plantes en se formant à un large ensemble de concepts et techniques, relevant de la biologie et de la génétique moléculaires (e.g., clonages et transformations, génotypage, utilisation de mutants), de la biologie cellulaire (imagerie cellulaire de fusions GFP par microscopie confocale, imagerie calcique), de l'électrophysiologie (patch-clamp) et de la physiologie de la symbiose fixatrice d'azote. Bibliographie Cárdenas L, Feijó JA, Kunkel JG, Sánchez F, Holdaway-Clarke T, Hepler PK, Quinto C (1999). Rhizobium nod factors induce increases in intracellular free calcium and extracellular calcium influxes in bean root hairs. Plant J. 19: 347-352. Charpentier M., Bredemeier R., Wanner G., Takeda N., Schleiff E., Parniske M. (2008). Lotus japonicus CASTOR and POLLUX are ion channels essential for perinuclear calcium spiking in legume root endosymbiosis. Plant Cell 20: 3467–3479. Felle HH, Kondorosi E, Kondorosi A, Schultze M (1998). The role of ion fluxes in Nod factor signalling in Medicago sativa. Plant J. 13: 455–463. Felle HH, Kondorosi E, Kondorosi A, Schultze M (1999). Elevation of the cytosolic free Ca2+ is indispensable for the transduction of the Nod factor signal in alfalfa. Plant Physiol. 121: 273–279. Foreman J., Demidchik V., Bothwell J.H.F., Mylona P., Miedema H., Torres M.A., Linstead P., Costa S., Brownlee C., Jones J.D.G., Davies J.M., Dolan L. (2003). Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth. Nature 422: 442- 446. Kurkdjian A, Bouteau F, Pennarun A-M, Convert M, Cornel D, Rona J-P, Bousquet U (2000). Ion currents involved in early Nod factor response in Medicago sativa root hairs: a discontinuous single-electrode voltage-clamp study. Plant J. 22: 9-17. Michard E, Alves F, Feijó JA (2009). The role of ion fluxes in polarized cell growth and morphogenesis: the pollen tube as an experimental paradigm. Int. J. Dev. Biol. 53: 1609-1622. Oldroyd G.E. and Downie J.A. (2008). Coordinating nodule morphogenesis with rhizobial infection in legumes. Ann. Rev. Plant Biol. 59: 519-546. Véry A.-A. and Davies J.M. (2000). Hyperpolarization-activated calcium channels at the tip of Arabidopsis root hairs. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 9801-9806. Wais RJ, Galera C, Oldroyd G, Catoira R, Penmetsa RV, Cook D, Gough C, Dénarié J, Long SR (2000). Genetic analysis of calcium spiking responses in nodulation mutants of Medicago truncatula. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97: 13407–13412. Walker SA, Viprey V, Downie JA (2000). Dissection of nodulation signaling using pea mutants defective for calcium spiking induced by Nod factors and chitin oligomers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 13413–13418. Wang Y, Chen Z-H, Zhang B, Hills A, MR Blatt (2013). PYR/PYL/RCAR abscisic acid receptors regulate K+ and Cl- channels through reactive oxygen species-mediated activation of Ca2+ channels at the plasma membrane of intact Arabidopsis guard cells. Plant Physiol. 163: 566–577. White PJ, Bowen HC, Demidchik V, Nichols C, JM Davies (2002). Genes for calcium-permeable channels in the plasma membrane of plant root cells. B. B. A. 1564: 299– 309.

  • Titre traduit

    Molecular dialogue during the establishment of the rhizobial symbiosis: Analysis of the involvement of ion channels participating to electrical and calcic signals in the root hair of Medicago truncatula


  • Résumé

    Contexte scientifique La symbiose Légumineuse-Rhizobium permet l'assimilation de l'azote atmosphérique. Elle présente de ce fait un intérêt agronomique et écologique majeur, permettant de limiter l'apport d'engrais azotés (Oldroy et Downie, 2008). Les poils absorbants jouent un rôle déterminant dans l'établissement de l'interaction de la plante avec ses microsymbiotes. L'émission de facteurs NOD par les bactéries partenaires permet au poil absorbant de percevoir la présence de ces bactéries. L'infection est initiée par l'adhésion des bactéries au poil et une réorientation de la croissance apicale de cette cellule, conduisant à la formation d'une 'crosse de berger', qui constitue le point d'infection à partir duquel un cordon d'infection est initié, par invagination de la membrane plasmique de la cellule du poil absorbant (Oldroy et Downie, 2008). Les évènements de signalisation plante-bactérie qui ont été identifiés à ce jour comme les plus précoces, déclenchés immédiatement après la perception des facteurs NOD, se traduisent par des échanges rapides d'anions et de cations (Ca2+, K+, H+) entre le poil absorbant et le milieu extérieur, conduisant à un signal électrique (dépolarisation transitoire de la membrane cellulaire) et à un signal calcique (Felle et al., 1998 ; Felle et al., 1999 ; Cárdenas et al., 1999; Kurkdjian et al., 2000). L'activation de canaux anioniques, se traduisant par un efflux d'anions, serait à l'origine de la dépolarisation de la membrane, qui activerait des canaux perméables à Ca2+, responsables d'un influx de calcium à l'origine du signal calcique. Des canaux potassiques permettant un efflux de K+ s'activeraient en réponse à la dépolarisation membranaire, entraînant une repolarisation de la membrane cellulaire. Le sujet de thèse s'inscrit dans un projet initié par l'équipe d'accueil, qui vise à obtenir une vision d'ensemble de l'implication des canaux ioniques de la membrane plasmique du poil absorbant et de leur régulation lors de l'interaction entre la légumineuse modèle Medicago truncatula, dont le séquençage du génome est achevé, et son symbiote Sinorhizobium meliloti. L'équipe a récemment conduit une approche de 'séquençage massif' des transcrits exprimés dans le poil absorbant de Medicago truncatula avant et après (4 h ou 20 h) la perception des facteurs NOD. Elle a ainsi pu déterminer le répertoire des canaux ioniques potentiels exprimés dans cette cellule. Elle a simultanément développé un système de dissection laser de la paroi du poil absorbant permettant d'avoir directement accès à la membrane cellulaire et de caractériser ainsi les canaux ioniques actifs sur cette membrane par patch clamp. L'ensemble de ce travail a permis l'identification d'un canal d'efflux de K+, appartenant à la famille Shaker, exprimé dans le poil absorbant, actif sur la membrane cellulaire et régulé en réponse aux facteurs NOD. Nous voulons maintenant utiliser les connaissances que nous avons acquises (par 'deep sequencing') et les outils que nous avons développés ('dissection laser/patch clamp') au cours de ce travail, pour identifier sur le plan moléculaire et caractériser sur le plan fonctionnel les canaux calciques de la membrane du poil absorbant. Le choix de cet objectif est motivé par deux raisons fondamentales: (i) d'une part, parce que la signalisation calcique joue un rôle majeur dans l'interaction rhizobium-poil absorbant, mais qui est encore très peu compris (Wais et al., 2000; Walker et al., 2000; Oldroy et Downie, 2008; Charpentier et al., 2008), (ii) d'autre part parce que, de façon très générale, l'état des connaissances sur l'identité moléculaire des canaux calciques chez les plantes est encore très insuffisant, et que progresser dans cette direction présente un intérêt considérable en biologie végétale de façon générale, par exemple dans le contrôle de la croissance polarisée des cellules telles le poil absorbant ou le tube pollinique (Véry & Davies, 2000; Foreman et al., 2003; Michard et al., 2009), ou dans le contrôle de l'ouverture stomatique (Wang et al. 2013)). Programme de recherche L'hypothèse consensuelle à ce jour est que les canaux calciques sont très probablement codés par deux familles multigéniques, appelées CNGC (Cyclic Nucleotide Gated Channels) et GLR (GLutamate Receptor-like) (White et al., 2002). Ces 2 familles comportent respectivement 22 et 18 membres chez M. truncatula. Les données que nous avons obtenues par 'deep sequencing' du transcriptome du poil absorbant de M. truncatula identifient essentiellement 4 gènes CNGC et 3 gènes GLR comme exprimés dans ces cellules. De plus, un de ces 4 gènes CNGC et un de ces 3 gènes GLR sont beaucoup plus exprimés que les autres. Le travail de thèse aura pour objectif d'analyser la fonction de cet ensemble de 7 gènes, en donnant la priorité chronologiquement, aux deux gènes les plus exprimés. La démarche reposera sur la caractérisation de plantes mutantes perte de fonction. De façon simplifiée, les différentes étapes du projet seront: 1) Obtention des lignées mutantes perte de fonction pour les 2 gènes prioritaires, puis pour les 5 autres gènes, à partir des collections internationales de mutants. Génotypage pour obtenir des lignées homozygotes. Vérification de l'absence de transcrit dans la plante (perte de fonction) 2) Biologie cellulaire: localisation subcellulaire des canaux CNGC et GLR cibles: vérification de leur présence sur la membrane plasmique à l'aide de fusions avec la protéine fluorescente GFP; conséquences d'une co-expression de plusieurs membres de la même famille (CNGC ou GLR) sur la localisation subcellulaire (parce que ces canaux peuvent avoir une structure hétérotétramérique) 3) Imagerie calcique: conséquences des mutations 'perte de fonction' sur la signalisation calcique dans le poil absorbant en réponse aux facteurs NOD. Analyse comparative des plantes de génotype sauvage ou mutant. 4) Electrophysiologie des canaux calciques sur la membrane du poil absorbant en réponse aux facteurs NOD. Analyse comparative des plantes de génotype sauvage ou mutant. 5) Phénotypage des plantes mutantes: analyse de leur capacité à établir une relation symbiotique avec les bactéries fixatrices (analyse de la déformation des poils absorbants après traitement par des facteurs NOD, nombre de nodules par plante...). Conclusion: intérêt du projet et formation pour l'étudiant Au niveau fondamental, ce programme concerne de façon générale les mécanismes de signalisation calcique dans les interactions symbiotiques pante-bactérie fixatrice d'azote. Ce programme fournit aussi un angle d'attaque original pour identifier au niveau moléculaire et fonctionnel in situ des canaux ioniques impliqués dans la signalisation calcique chez les plantes, un domaine dans lequel les connaissances actuelles sont encore relativement réduites et débattues. Au niveau de la formation du doctorant, le programme de Thèse lui permettra d'acquérir une expérience en biologie intégrative des plantes en se formant à un large ensemble de concepts et techniques, relevant de la biologie et de la génétique moléculaires (e.g., clonages et transformations, génotypage, utilisation de mutants), de la biologie cellulaire (imagerie cellulaire de fusions GFP par microscopie confocale, imagerie calcique), de l'électrophysiologie (patch-clamp) et de la physiologie de la symbiose fixatrice d'azote. Bibliographie Cárdenas L, Feijó JA, Kunkel JG, Sánchez F, Holdaway-Clarke T, Hepler PK, Quinto C (1999). Rhizobium nod factors induce increases in intracellular free calcium and extracellular calcium influxes in bean root hairs. Plant J. 19: 347-352. Charpentier M., Bredemeier R., Wanner G., Takeda N., Schleiff E., Parniske M. (2008). Lotus japonicus CASTOR and POLLUX are ion channels essential for perinuclear calcium spiking in legume root endosymbiosis. Plant Cell 20: 3467–3479. Felle HH, Kondorosi E, Kondorosi A, Schultze M (1998). The role of ion fluxes in Nod factor signalling in Medicago sativa. Plant J. 13: 455–463. Felle HH, Kondorosi E, Kondorosi A, Schultze M (1999). Elevation of the cytosolic free Ca2+ is indispensable for the transduction of the Nod factor signal in alfalfa. Plant Physiol. 121: 273–279. Foreman J., Demidchik V., Bothwell J.H.F., Mylona P., Miedema H., Torres M.A., Linstead P., Costa S., Brownlee C., Jones J.D.G., Davies J.M., Dolan L. (2003). Reactive oxygen species produced by NADPH oxidase regulate plant cell growth. Nature 422: 442- 446. Kurkdjian A, Bouteau F, Pennarun A-M, Convert M, Cornel D, Rona J-P, Bousquet U (2000). Ion currents involved in early Nod factor response in Medicago sativa root hairs: a discontinuous single-electrode voltage-clamp study. Plant J. 22: 9-17. Michard E, Alves F, Feijó JA (2009). The role of ion fluxes in polarized cell growth and morphogenesis: the pollen tube as an experimental paradigm. Int. J. Dev. Biol. 53: 1609-1622. Oldroyd G.E. and Downie J.A. (2008). Coordinating nodule morphogenesis with rhizobial infection in legumes. Ann. Rev. Plant Biol. 59: 519-546. Véry A.-A. and Davies J.M. (2000). Hyperpolarization-activated calcium channels at the tip of Arabidopsis root hairs. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 9801-9806. Wais RJ, Galera C, Oldroyd G, Catoira R, Penmetsa RV, Cook D, Gough C, Dénarié J, Long SR (2000). Genetic analysis of calcium spiking responses in nodulation mutants of Medicago truncatula. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 97: 13407–13412. Walker SA, Viprey V, Downie JA (2000). Dissection of nodulation signaling using pea mutants defective for calcium spiking induced by Nod factors and chitin oligomers. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 97: 13413–13418. Wang Y, Chen Z-H, Zhang B, Hills A, MR Blatt (2013). PYR/PYL/RCAR abscisic acid receptors regulate K+ and Cl- channels through reactive oxygen species-mediated activation of Ca2+ channels at the plasma membrane of intact Arabidopsis guard cells. Plant Physiol. 163: 566–577. White PJ, Bowen HC, Demidchik V, Nichols C, JM Davies (2002). Genes for calcium-permeable channels in the plasma membrane of plant root cells. B. B. A. 1564: 299– 309.