Microscopie à fluorescence sélective et volumétrique pour la localisation de molécules uniques dans des environnements encombrés

par Tommaso Galgani

Projet de thèse en Physique

Sous la direction de Bassam Hajj.

Thèses en préparation à l'Université Paris sciences et lettres , dans le cadre de Physique en Ile de France , en partenariat avec Laboratoire Physico-Chimie Curie (laboratoire) et de Institut Curie (établissement opérateur d'inscription) depuis le 02-10-2017 .


  • Résumé

    L'imagerie de la molécule unique (SM) offre un moyen d'étudier l'organisation et la dynamique à l'échelle nanométrique des biomolécules avec une haute résolution temporelle et spatiale. Cependant, la profondeur d'imagerie limitée d'un microscope SM standard ne reflète pas l'organisation volumétrique inhérente des organites internes des cellules et limite la gamme des dynamiques SM qui peuvent être observées en 3D. La réalisation d'une imagerie SM efficace avec une grande précision de localisation dans un échantillon biologique volumétrique est confrontée à deux défis principaux. Premièrement, les molécules excitées hors foyer produisent un bruit de fond élevé qui affecte la précision de la localisation. Deuxièmement, les molécules qui diffusent rapidement ont tendance à échapper à la profondeur de champ limitée de l'objectif du microscope d'imagerie. Pour relever ces défis, nous proposons une nouvelle méthode d'imagerie volumétrique sélective et réellement instantanée avec une sensibilité SM. Dans le cadre de mon projet de doctorat, nous avons développé un système modulaire dont le cœur est constitué de deux techniques de pointe : la microscopie multifocale (MFM) et la microscopie sélective à illumination plane à objectif unique (soSPIM). Grâce à la MFM, notre système est capable d'imager instantanément un volume avec une haute résolution temporelle et une sensibilité SM. Nous avons remodelé l'architecture du soSPIM afin de créer une excitation de la nappe lumineuse accordable et uniforme qui correspond à la gamme de détection souhaitée avec la MFM. Nous avons illustré l'avantage de notre méthode en imagerie la dynamique des facteurs nucléaires tels que H2B, CTCF et Cohesin à plusieurs microns de profondeur dans les cellules U2OS et STEM embryonnaires de souris avec une haute résolution temporelle et spatiale. Nous avons pu imager la dynamique des SM jusqu'à 50 volumes de 35×35×4μ m^3 par seconde. Enfin, nous avons reconstruit des images volumétriques de super-résolution de la membrane nucléaire, en réalisant des DNA-PAINT sur la protéine Lamin-b. Cette thèse ouvre la voie à l'exploration de l'organisation et de la dynamique moléculaires à haute résolution temporelle et spatiale dans les organismes et tissus multicellulaires.

  • Titre traduit

    Selective and volumetric fluorescence microscopy for single-molecule localization in crowded environments


  • Résumé

    Single-molecule (SM) imaging offer a mean to investigate the nanoscale organization and dynamics of biomolecules with high temporal and spatial resolution. However, the limited imaging depth of a standard SM microscope does not reflect the inherent volumetric organization of the inner organelles of cells and limits the range of SM dynamics that can be observed in 3D. Performing efficient SM imaging with high localization precision in a volumetric biological sample faces two main challenges. First, excited out-of-focus molecules produce high background noise that affect the localization precision. Second, fast diffusing molecules tend to escape the limited depth of field of the imaging microscope objective. To address these challenges, we propose a new method for selective and true instantaneous volumetric imaging with SM sensitivity. In my PhD project, we developed a modular system, with, at the core, two cutting-edge techniques: multifocus microscopy (MFM) and single-objective selective plane illumination microscopy (soSPIM). Thanks to the MFM, our system is able to image instantaneously a volume with high temporal resolution and SM sensitivity. We remodeled the soSPIM architecture in order to create a tunable and uniform light sheet excitation that matches the desired range of detection with MFM. We illustrated the advantage of our method by imaging the dynamics of nuclear factors such as H2B, CTCF and Cohesin at several microns deep in U2OS and mouse embryonic STEM cells with high temporal and spatial resolution. We were able to image SM dynamics up to 50 volumes of 35×35×4μ m^3 size per second. Finally, we reconstructed volumetric super-resolution images of the nuclear membrane, performing DNA-PAINT on the Lamin-b protein. This thesis paves the way for exploring the molecular organization and dynamics at high temporal and spatial resolution in multicellular organisms and tissues.