Exploration de la diversité métabolique cryptique des Streptomyces via la mise en œuvre d'une stratégie innovante pour la recherche de nouveaux anti-microbiens

par Orianne Brel

Projet de thèse en Chimie des substances naturelles

Sous la direction de Marc Litaudon et de Marie-Joëlle Virolle.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (2015-.... ; Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine) , en partenariat avec Cnrs UPR 2301 - Institut de Chimie des Substances Naturelles (ICSN) (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 02-10-2017 .


  • Résumé

    De nos jours, de plus en plus de micro-organismes pathogènes, en particulier les bactéries à Gram négatif, sont résistants à la plupart des antibiotiques connus, tandis que la découverte et la commercialisation de nouveaux antibiotiques est devenue un processus rare, lent et coûteux (1). En effet, seules deux nouvelles classes d'antibiotiques ont été mises sur le marché depuis les années soixante, alors que plus de 20 classes d'antibiotiques ont été développées entre 1940 et 1960 (2). Le pipeline de découverte d'antibiotiques semble se tarir et des personnes meurent à nouveau des maladies infectieuses comme c'était le cas avant l'ère des antibiotiques (3). Ces deux situations constituent un enjeu de santé publique majeur. En effet, la résistance aux antibiotiques est l'une des plus grandes menaces pour la santé mondiale, la sécurité alimentaire et le développement. La résistance aux antibiotiques est à des niveaux dangereusement élevés dans toutes les parties du monde. De nouveaux mécanismes de résistance émergent, se répandent rapidement menaçant l'efficacité des traitements habituels de maladies infectieuses banales et conduisent à la recrudescence des infections nosocomiales en milieu hospitalier. Les stratégies de lutte contre les résistances microbiennes aux antibiotiques sont de plus en plus difficiles et complexes à concevoir compte tenu de l'inefficacité croissante des antibiotiques au fur et à mesure de leurs utilisations continues et soutenues (4). Il est nécessaire aujourd'hui de réduire le taux d'infection et lutter contre les microorganismes multi-résistants. Dans ce contexte, la découverte de nouveaux antibiotiques, y compris celle de petites molécules capables d'inhiber les mécanismes de résistance aux antibiotiques ainsi que la formation de biofilm, est devenue une absolue nécessité. Une source importante d'antibiotiques ainsi que d'autres molécules bioactives est le genre Streptomyces (5). Les Streptomyces spp. sont des bactéries à Gram + filamenteuses et sporulantes qui vivent dans les couches superficielles de divers milieux terrestres ou marins. Ce genre bactérien est aussi probablement la source de déterminants génétiques codant les mécanismes de résistance aux antibiotiques ainsi que pour les molécules inhibant ces derniers (ex: inhibiteur des beta-lactamases, enzymes responsables de la résistance aux antibiotiques appartenant à la famille des beta-lactamines) (6.) Chaque espèce de Streptomyces est connue pour produire un petit nombre de molécules bioactives (un à quatre), mais le séquençage récent des génomes de plusieurs espèces de ce genre a révélé que chaque génome comporte 20 à 40 « clusters » capables de diriger la biosynthèse de métabolites secondaires potentiellement bioactifs (7). Ceci indique que la plupart des voies détectées in silico sont trop peu exprimées (cryptiques) dans des conditions habituelles de laboratoire pour permettre la détection et donc la caractérisation du produit synthétisé. Une meilleure compréhension de la fonction de ces molécules pour le producteur lui-même ainsi que la conception et la mise en œuvre de stratégies innovantes sont nécessaires pour améliorer l'expression de ces voies cryptiques afin d'accéder à cette immense diversité métabolique susceptible d'inclure un large panel de molécules bioactives (8). La production industrielle de ces nouvelles molécules bioactives aurait un impact positif évident sur la santé humaine et pourrait aider à traiter les infections pour lesquelles il n'existe plus aucun traitement disponible. Le but du projet est de découvrir de nouveaux antibiotiques et/ou de nouvelles molécules inhibant les mécanismes de résistance de microbes pathogènes par l'analyse comparative des métabolomes de différentes souches de Streptomyces dont on aura stimulé ou non l'expression des voies de biosynthèse cryptiques. Ce projet implique l'utilisation d'un nouvel outil (brevet en cours de dépôt) conçu par le groupe MES de l'I2BC. La conception de l'outil de «décryptification» repose sur le fait bien établi que la production d'antibiotiques a lieu lorsque la croissance ralentit ou s'arrête lorsque les nutriments (en particulier le phosphate) et donc l'énergie sont limités (9,10) . Ces observations suggérant qu'un déficit énergétique pourrait être un facteur important pour le déclenchement de la production d'antibiotiques, le groupe MES a mis en œuvre trois stratégies différentes visant à générer un déficit artificiel en ATP chez la souche modèle Streptomyces lividans qui sont l'interruption du gène ppk (11), la sur-expression d'une ATPase (manuscrit en préparation) et la sur-expression d'une petite protéine synthétique très affine à l'ATP (Collaboration avec John Chaput, Université de Californie, USA, dépôt de brevet en cours). Cette dernière possède des voies de biosynthèse bien caractérisées pour la production de trois antibiotiques peptidiques ou polycétides (CDA, ACT et RED) mais les exprime très faiblement. Dans les trois cas, ce déficit énergétique a entrainé le déclenchement de la production d'antibiotiques. Dans ce projet, nous visons à appliquer une de ces stratégies prometteuses (dépôt de brevet en cours) à d'autres espèces de Streptomyces faiblement productrices d'antibiotiques afin de purifier et d'identifier les nouvelles molécules produites et de déterminer leurs activités biologiques. La complémentarité des deux équipes impliquées dans ce projet est essentielle et permet de mettre en œuvre une nouvelle approche pour la recherche d'antimicrobiens. En effet, le groupe MES de l'I2BC (12) possède une expertise dans le domaine de la génétique des Streptomyces et a conçu le système de « décryptification » et le groupe « Métabolite secondaire de plante et de leurs endophytes associés : isolement, synthèse et bioactivité» de l'ICSN (13) est spécialisé dans l'analyse chimique du métabolome des substances naturelles, l'isolement et la détermination structurale des métabolites secondaires (MS) de plantes et de microorganismes. Ce groupe possède une expertise dans la recherche de molécules thérapeutique et s'est focalisé entre autre sur la recherche d'antimicrobiens.

  • Titre traduit

    Exploration of the cryptic metabolic diversity of Streptomyces via the implementation of an innovative strategy for the detection of new antimicrobials


  • Résumé

    Nowadays, more and more pathogenic micro-organisms, particularly Gram-negative bacteria, are resistant to most known antibiotics, while the discovery and commercialization of new antibiotics has become a rare, slow and expensive process (1). Indeed, only two new classes of antibiotics have been on the market since the 1960s, when more than 20 classes of antibiotics were developed between 1940 and 1960 (2). The discovery pipeline d Antibiotics seems to be drying up and people are dying of infectious diseases again as was the case before the antibiotic era (3). These two situations constitute a major public health issue. Antibiotic resistance is one of the greatest threats to global health, food security and development. Antibiotic resistance is at dangerously high levels in all parts of the world. New mechanisms of resistance emerge, spread rapidly threatening the effectiveness of the usual treatments of infectious diseases banal and lead to the recrudescence of nosocomial infections in hospital. Strategies to combat microbial resistance to antibiotics are increasingly difficult and complex to design, given the increasing ineffectiveness of antibiotics as they are used continuously and continuously (4). It is necessary today to reduce the rate of infection and to combat multi-resistant microorganisms. In this context, the discovery of new antibiotics, including that of small molecules capable of inhibiting antibiotic resistance mechanisms as well as the formation of biofilm, has become an absolute necessity. An important source of antibiotics as well as other bioactive molecules is the genus Streptomyces (5). Streptomyces spp. are filamentous and sporulating Gram + bacteria that live in the superficial layers of various terrestrial or marine environments. This bacterial genus is also probably the source of genetic determinants encoding antibiotic resistance mechanisms as well as molecules that inhibit antibiotics (eg beta-lactamase inhibitors, enzymes responsible for resistance to antibiotics belonging to the beta-lactam family ) (6). Each species of Streptomyces is known to produce a small number of bioactive molecules (one to four), but recent genome sequencing of several such species has revealed that each genome has 20 to 40 clusters capable of directing the biosynthesis of potentially bioactive secondary metabolites (7). This indicates that most of the paths detected in silico are too little expressed (cryptic) under normal laboratory conditions to allow the detection and therefore the characterization of the synthesized product. A better understanding of the function of these molecules for the producer himself as well as the design and implementation of innovative strategies are needed to improve the expression of these cryptic pathways in order to access this immense metabolic diversity, supposed to include a wide range of bioactive molecules (8). The industrial production of these new bioactive molecules would have a clear positive impact on human health and could help treat infections for which there is no available treatment. The aim of the project is to discover new antibiotics and / or new molecules that inhibit the resistance mechanisms of pathogenic microbes by comparative analysis of the metabolomes of different strains of Streptomyces which will be stimulated or not the expression of the cryptic biosynthesis pathways . This project involves the use of a new tool (patent pending) designed by the MES group of the I2BC.The design of the 'decrypting' tool is based on the well-established fact that antibiotic production occurs when growth slows down or stops when nutrients (especially phosphate) and therefore energy are limited (9,10). These observations suggesting that an energy deficit could be an important factor in initiating the production of antibiotics, the MES group has implemented three different strategies, which aimied at generating an artificial deficiency in ATP in the strain Streptomyces lividans, which are: Interruption of the ppk gene (11), overexpression of an ATPase (manuscript in preparation), and overexpression of a small ATP-refined synthetic protein (Collaboration with John Chaput, University of California, USA , Patent pending).The latter possesses well-characterized biosynthetic pathways for the production of three peptide or polyketide antibiotics (CDA, ACT and RED) but expresses them very poorly. In all three cases, this energy deficit has triggered the production of antibiotics. In this project, we aim to apply one of these promising strategies (patent pending) to other species of Streptomyces weakly producing antibiotics in order to purify and identify the new molecules produced and to determine their biological activities. The complementarity of the two teams involved in this project is essential and allows a new approach to antimicrobial research to be implemented. Indeed, the MES group of I2BC has expertise in the field of Streptomyces genetics and has designed the 'decrypting' system and the 'Secondary plant metabolite and their associated endophytes: isolation, synthesis and bioactivity' group of ICSN is specialized in chemical analysis of the metabolism of natural substances, isolation and structural determination of secondary metabolites (MS) of plants and microorganisms. This group has expertise in the research of therapeutic molecules and has focused on antimicrobial research.