Analyse structurale des antagonistes de l'interféron de pneumovirus

par Claire-marie Caseau

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Christina Sizun.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué (Châtenay-Malabry, Hauts-de-Seine ; 2015-....) , en partenariat avec Institut de Chimie des Substances Naturelles (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2017 .


  • Résumé

    Le virus respiratoire syncytial (RSV) est le principal agent responsable d'infections graves des voies respiratoires basses chez le nouveau-né. Actuellement il n'existe ni de traitement ni de vaccin efficace pour la forme humaine (hRSV). Le RSV est un membre du genre Pneumovirus (famille des Pneumoviridae, ordre des Mononegavirales). Le RSV induit une réponse immunitaire remarquablement faible, en comparaison avec d'autres virus apparentés, et a évolué vers une stratégie unique d'évasion des mécanismes de défense immunitaire de l'hôte : il code pour deux protéines non structurales (NS) : NS1 et NS2. Ce sont les deux premiers gènes transcrits et les protéines les plus abondantes au cours d'une infection par le RSV. Les deux sont requises pour une réplication efficace du virus dans des modèles cellulaires et animaux. Il a été montré que hRSV NS1 et NS2 étaient des antagonistes des interférons (IFN) de type I et III, par régulation négative de la synthèse et de la signalisation des IFN. NS1 et NS2 sont donc toutes deux considérées comme des cibles potentielles pour la prévention et le traitement du RSV. Cependant leurs mécanismes d'action ne sont pas bien connus. Leur structure n'est pas non plus connue et il n'existe pas d'homologues en-dehors des protéines NS de Pneumovirus. L'objectif de cette thèse est d'obtenir des informations structurales à haute résolution sur des protéines NS de Pneumovirus. hRSV NS1 et NS2 sont de petites protéines, de 139 et 124 résidus respectivement dans le cas du hRSV. Elles sont hautement conservées à travers les espèces (humain, bovin and ovin). Des études biochimiques antérieurs suggèrent que ces protéines sont monomères et contiennent des régions non structurées. Elles seraient donc particulièrement adaptées pour une étude structurale par RMN. Au laboratoire nous avons récemment réussi à optimiser le protocole de production et de purification de hRSV NS1 recombinante en grandes quantités. En accord avec des publications d'autres groupes, nous avons observé que NS1 était susceptible d'agréger dans des conditions non réductrices, en raison de la réactivité de ces cystéines, conservées. Après criblage de différentes conditions expérimentales, nous avons pu mener des études structurales préliminaires par CD et RMN. Elles indiquent que NS1 est plutôt une protéine dimère, avec un coeur structuré, en équilibre avec des formes oligomères d'ordre supérieur. Nous voulons maintenant poursuivre une caractérisation structurale de hRSV par RMN. Ainsi nous proposons d'obtenir des données structurales de haute résolution de la forme soluble de NS1 par RMN. Des essais de cristallogenèse seront effectués en parallèle. Les structures de protéines NS du RSV seront comparées entre elles : NS1 avec NS2, NS de différentes espèces et NS du virus de la pneumonie de la souris (PVM). D'autre part NS1 et NS2 peuvent former des oligomères et il a été montré que des oligomères stables de hRSV NS1 avaient des propriétés amyloïdes, telles que la fixation de thioflavine T et un accroissement de structure secondaire en feuillet beta. Des techniques de diffraction de la lumière (DLS, SAXS) et de microscopie (AFM, EM) seront mises en oeuvre pour déterminer la forme globale des oligomères, complétées par la RMN du solide pour caractériser leur structure et la comparer à celle de NS1 agrégée. Enfin, comme les protéines amyloïdogènes ont une propension à s'associer avec des membranes, il est envisagé d'étudier des interactions avec des membranes modèles (liposomes).

  • Titre traduit

    Structural analysis of pneumovirus interferon antagonists


  • Résumé

    Respiratory syncytial virus (RSV) is the main agent responsible for acute lower respiratory tract infections in infants. No vaccine and no efficient treatment are presently available for the human form (hRSV). RSV is a member of the genus Pneumovirus (Pneumoviridae family, Mononegavirales order). RSV elicits remarkably weak innate immune response, as compared to related viruses, and has evolved a unique strategy to evade host defense mechanisms: it encodes two nonstructural (NS) proteins, NS1 and NS2, which are the two first genes transcribed and the most abundant RSV proteins upon infection. They are required for efficient virus replication in cell culture and animal models. hRSV NS1 and NS2 have been shown to antagonize type I and III interferon (IFN) by downregulating IFN synthesis and IFN signaling. Both NS1 and NS2 are thus considered to be effective targets for prevention and treatment of RSV. However their mechanisms of action are not well understood. Their structure is unknown and no homologs are known outside Pneumovirus NS proteins. The aim of this thesis is to obtain high resolution structural information of Pneumovirus NS proteins. hRSV NS1 and NS2 are small protein, of 139 and 124 residues respectively for hRSV. They are highly conserved among species (human, bovine and ovine). Previous biochemical reports of NS proteins suggested that these proteins are monomeric and contain unstructured regions, which makes them particularly attractive for NMR characterization. At the laboratory we have recently succeeded in optimizing the production and purification of recombinant hRSV NS1 with high yields. In line with previous reports, we have observed that NS1 is prone to aggregation under non reducing conditions, due to the high reactivity of its conserved cysteines. After screening various conditions, we were able to carry out preliminary structural investigations by CD and NMR. They indicate that NS1 is probably a dimeric protein, with a structured core, in equilibrium with higher order oligomeric forms. Further structural characterization of hRSV NS1 by NMR is now feasible. We thus propose to obtain high resolution structural data of soluble NS1 by NMR. However, crystallization trials will be carried out in parallel. Structural comparison of RSV NS proteins will be carried out, between NS1 and NS2, between species, but also with PVM NS proteins, which are much less conserved, but also involved in inflammatory response upon infection. NS1 and NS2 are able to form oligomers. Moreover it was shown previously that stable hRSV NS1 oligomers displayed amyloid behavior, such as Thioflavine T binding and increased beta-sheet secondary structure content. This needs to be investigated further. We will use light scattering techniques (DLS, SAXS) and microscopy (AFM, EM) to determine their overall shape. We will also use solid state NMR to characterize the structure of NS oligomers and assess the difference with aggregated NS1, for which we have acquired preliminary results. Finally, since amyloidogenic proteins have a propensity to associate with membranes, we will investigate possible interaction with model membranes.