Mécanismes de trafic et de rétention de la triadine au sein du muscle squelettique

par Perrine Teyssier (Aubin)

Projet de thèse en Biologie cellulaire

Sous la direction de Julien Faure (edcsv).

Thèses en préparation à Grenoble Alpes , dans le cadre de Chimie et Sciences du Vivant , en partenariat avec Grenoble Institut des Neurosciences (laboratoire) et de Equipe - Isabelle Marty - CSV - Myologie et Pathologies (equipe de recherche) depuis le 01-10-2016 .


  • Résumé

    Le muscle squelettique est un tissu complexe constitué de nombreuses cellules musculaires. Lorsqu'un motoneurone en contact avec ces cellules, émet un potentiel d'action, celui-ci se propage le long de la membrane plasmique où il permet l'activation du complexe de relâchement du calcium (CRC), la sortie massive de calcium dans le cytosol, et ainsi la contraction. Le CRC est un complexe multiprotéique, localisé au sein des triades (ensemble composé d'un tubule-transverse (TT) et de deux citernes terminales du réticulum sarcoplasmique (RS)), et est centré autour de deux canaux calciques : le Récepteur des Dihydropyridines (DHPR) et le Récepteur de la Ryanodine (RyR). Ces deux canaux sont très précisément localisés face à face dans leurs membranes respectives : la membrane du TT et la membrane du RS. Le CRC contient également d'autres protéines comme la calséquestrine ou la triadine, ayant des rôles clés pour la libération du calcium. L'initiation de la contraction dépend de la localisation précise et exclusive des protéines du CRC au sein de la triade. Des mutations des protéines du CRC peuvent provoquer des pathologies musculaires, telles que l'hyperthermie maligne ou les myopathies à cores centraux, majoritairement dues à des mutations du gène RyR1. Si de manière relativement fréquente ces mutations altèrent les relâchements calciques et donc la fonction musculaire, une autre hypothèse physiopathologique pourrait être une mauvaise localisation des protéines du CRC, entrainant une dérégulation du fonctionnement du complexe. Néanmoins, les mécanismes sous-jacents à la formation et l'organisation de la triade ainsi qu'à l'adressage des protéines du complexe dansce compartiment unique, restent inconnus. Afin de tester cette hypothèse physiopathologique actuellement encore peu étudiée, la compréhension des mécanismes de mise en place de la triade est nécessaire. Pour cela, nous nous sommes focalisés sur la triadine, une protéine des citernes terminales du RS et appartenant au CRC. En effet, la triadine servirait de point d'ancrage aux autres protéines du CRC du fait que ses domaines fonctionnels lui permettent d'interagir avec le RyR et la calséquestrine, mais également avec les microtubules. Les travaux précédents du laboratoire ont permis, grâce à l'expression de protéines fluorescentes (GFP ou photoactivable : PA-GFP) dans des cultures primaires de myoblastes de souris knockout pour la triadine, d'identifier certains mécanismes de mise en place de la triade. En effet il a été montré que la triadine-GFP s'organise très rapidement en plateformes dispersées et mobiles, lors de la différenciation des cellules. Ces plateformes se stabilisent une fois leur localisation finale atteinte, en double rangées de points, et cela grâce au réseau de microtubules. L'utilisation de triadine-PA-GFP a permis d'identifier que (i) la triadine diffuse constamment dans les membranes du RS, quel que soit le stade de différenciation des myotubes, (ii) qu'elle est ancrée à la triade en partie grâce à son domaine luminal et que (iii) l'absence du partenaire RyR n'affecte en rien cet ancrage. A la suite de ces premiers résultats sur l'organisation des triades et le trafic des protéines du CRC mon projet de thèse se focalisera plus particulièrement sur deux grands axes. D'un côté et par des techniques de microscopie confocale et biochimiques, nous caractériserons les plateformes mobiles détectées par la triadine-GFP : de quoi sont-elles composés ? et comment se déplacent-elles sur les microtubules : grâce aux moteurs moléculaires ou par fixation sur les extrémités(+) des microtubules ? D'un autre côté, nous nous intéresserons aux mécanismes de rétention : par quel(s) moyen(s) les protéines du CRC sont-elles retenues à la triade : par les interactions que la triadine peut avoir avec d'autres protéines?, grâce à ses domaines internes? ou grâce à la composition lipidique de la membrane des citernes terminales? Pour cela nous développerons des mutants de la triadine et utiliserons des traitements pharmacologiques. Ces résultats permettront d'acquérir de nouvelles connaissances sur les mécanismes de formation et de maturation de la triade, connaissances indispensables à l'exploration de la physiopathologie des mutations des protéines du CRC et ainsi pouvoir développer de nouvelles approches thérapeutiques.

  • Titre traduit

    Mechanisms of triadin trafficking and retention in skeletal muscle


  • Résumé

    Muscle contraction is initiated by a motoneuron in contact with muscle cells, which produces an action potential. The depolarization spreads throughout the plasma membrane to allow the activation of calcium release complex (CRC), a massive calcium release into the cytosol and thus the muscular contraction. The CRC is a multiproteic complex, localized in triads (group of one transverse-tubule (TT) and two terminal cisternae of sarcoplasmic reticulum (SR)), and is centered on two calcium channels: the Dihydropyridine Receptor (DHPR) and the Ryanodine Receptor (RyR). These channels are precisely localized face to face in their respective membrane (TT membrane for the DHPR and RS membrane for the RyR). The CRC contains also others proteins like calsequestrin or triadin that have important roles in regulating calcium releases. Therefore, contraction depends on the fine and exclusive localization of CRC proteins in the triad. Mutations in genes coding for CRC proteins are involved in muscle diseases like Malignant Hyperthermia or Central Core Disease, mostly due to mutations in RYR1 gene. If these mutations often alter calcium releases, another pathophysiological hypothesis could be an abnormal targeting of CRC proteins, leading to CRC dysfunction. Nevertheless, the mechanisms underlying the triad formation and the targeting of CRC proteins at the triad are still unknown. In order to test this pathophysiological hypothesis, the study of triad foramtion is necessary. To this end, we focuse our work on triadin, a protein belonging to CRC in the terminal cisternae of the SR. Indeed, Triadin is believed to serve as an anchor for other members of the CRC at the triads thanks to its luminal domains able to interact with RyR, calsequestrin and also with microtubules. Therefore triadin is an ideal candidate to investigate the mechanisms leading to exclusive positioning of all CRC proteins. Thanks to the expression of fluorescents proteins (GFP or photoactivable PA-GFP) in primary culture of myoblastes from triadin knockout mice, previous work of the lab allowed us to identify some mechanisms in the triad formation. Indeed, the GFP-triadin gets organized rapidly in moving and scattered clusters during the cell differentiation. These clusters stabilize when they reach their final localization, in double rows of dots, thanks to microtubules network. PA-GFP triadin utilization enable us to identify that (i) triadin constantly diffuses into the SR whatever the myotubes differentiation stage, (ii) triadin is anchored at the triad through its luminal part at least in part, and (iii) the absence of its RyR partner does not affect the dynamic of the triadin. Following these first results on formation of triads and CRC proteins trafficking, my PhD project will especially focus on two major axis. On one hand and with the use of confocal microscopy and biochemical methods, we will characterize the mobile clusters of GFP-triadin: what are they composed of? And how do they move on microtubules network: through binding to plus-ends of microtubules or thanks to molecular motors? On the other hand, we will focus on the retention mechanisms: by which means are the CRC proteins retained at the triad: through triadin interactions with other proteins? thanks to its intrinsic properties? or thanks to the lipid composition of terminal cisternae membrane? To this end we will develop triadin mutants and we will use pharmacological treatments. These outcomes should give us new knowledge on triad formation and maturation mechanisms, it is the starting point to explore the physiopathology of CRC proteins' mutations and to further develop potential therapies