Rôle des kinases du Médiateur CDK8 et CDK19 dans la physiologie cellulaire et la réponse au stress environnemental

par Lucie Angevin

Thèse de doctorat en Biologie Santé

Sous la direction de Daniel Fisher.

Thèses en préparation à Montpellier , dans le cadre de Sciences Chimiques et Biologiques pour la Santé , en partenariat avec IGMM - Institut de Génétique Moléculaire de Montpellier (laboratoire) et de Contrôle Nucléaire de la Prolifération Cellulaire (equipe de recherche) .


  • Résumé

    L'expression des gènes est régulée par l'intervention de nombreux facteurs sur la chromatine, avec parmi eux, le complexe multiprotéique Médiateur. C'est un complexe composé de quatre modules, qui transmet le signal des séquences enhancers à la machinerie transcriptionnelle. Le module kinase du Médiateur comporte CDK8 (Kinase dépendante de cycline 8), ou CDK19, de la même sous-famille des CDK. Ces kinases modulent de nombreuses voies transcriptionnelles, mais leurs mécanismes d'action ne sont pas bien définis. Par ailleurs, CDK8 est fréquemment décrite comme ayant des rôles dans les cancers, mais ceux-ci sont très variables d'un cancer à l'autre (effets pro- ou anti-tumoraux). Cependant les redondances et spécificités des deux kinases restent inconnues. L'objectif de ma thèse a été de caractériser les rôles des kinases du Médiateur, sur la prolifération cellulaire, l'expression des gènes ainsi que la réponse aux stress dans des modèles cellulaires. Après la génération de MEF (fibroblastes embryonnaires murins) contrôles, Cdk8, Cdk19 et Cdk8/19 KO par des approches de recombinaisons Cre-Lox inductibles et de CRISPR-Cas9, j'ai observé une réduction de la croissance des populations de MEF Cdk8/19 KO. La viabilité des cellules n'était pas affectée, mais la perte de Cdk8/19 a augmenté l'expression de l'inhibiteur du cycle cellulaire, p21. De plus, l'invalidation de CDK8 et CDK19 diminue la sortie des cellules de la quiescence induite par privation de sérum. J'ai également testé des inhibiteurs spécifiques de CDK8/19 in vitro. Dans ce but, j'ai testé leur effet sur CDK8/19 en étudiant un substrat modèle, la phosphorylation de la sérine 727 de STAT1. Le traitement des MEF avec un inhibiteur spécifique a entrainé une réduction de leur croissance. L'effet transcriptionnel de l'invalidation de Cdk8/19 ou de leur inhibition a ensuite été investigué. Même si le complexe Médiateur est essentiel à la transcription le transcriptome a été étonnamment peu dérégulé. La redondance de CDK8 et de CDK19 est clairement visible. L'effet de leur inhibition est distinct de leur invalidation génétique. Parmi les gènes dérégulés à la fois par l'inhibition et la mutation de Cdk8/19, nombreux sont des cibles de p53, comme les inhibiteurs du cycle cellulaire Cdkn1a, Cdkn1b et Cdkn1c. Les gènes impactés en réponse aux UV-C étaient également dérégulés, et c'est une piste que j'ai ensuite explorée. J'ai constaté que la perte, et non l'inhibition, de Cdk8/19 sensibilise les MEFs à l'apoptose induite par les UV-C. De plus, dans les MEF Cdk8/19 KO irradiés, la p53 est stabilisée précocement via la protéine PML. J'ai constaté que les corps nucléaires PML étaient localisée dans les zones denses en eGFP-CDK8, dont le signal était nucléaire et diffus. Etonnamment, la déplétion de p53 et PML par siRNA augmente l'apoptose induite par les UV-C dans les MEF Cdk8/19 KO. Il semblerait donc que la stabilisation de p53 via PML limite l'apoptose dans les cellules Cdk8/19 mutantes, peut-être en bloquant le cycle cellulaire. Enfin, il y a une augmentation des dommages à l'ADN ou de la réponse à ces dommages dans les MEF KO Cdk8/19. Ainsi, nos résultats sur CDK8/19 montrent l'importance de leur redondance et des différences liées à leur inhibition ou mutation. De plus, mes travaux laissent supposer que ces kinases, qui sont dispensables en condition basale, deviennent essentielles dans la réponse cellulaire au stress.

  • Titre traduit

    Role of the Mediator kinases CDK8 and CDK19 in cell physiology and response to environmental stress


  • Résumé

    Le nombre de caractères doit être compris entre 1700 caractères et 4000 caractères. Les résumés déposés ici doivent être identique aux résumés présents dans votre thèse. Gene expression is regulated by many chromatin factors including the Mediator complex. This multiprotein complex transmits the signal from enhancer sequences to the transcriptional machinery on promoters, and is composed of four modules. The kinase module contains CDK8 (Cyclin-dependant kinase 8), or CDK19 of the same CDK subfamily. These kinases modulate many transcriptional pathways. Furthermore, CDK8 has been ascribed various roles in cancers, which are highly variable depending on the context (pro- or anti-tumor effects). But since one kinase can replace the other in the kinase module, we do not yet understand the specific and redundant functions of these kinases. The objective of my thesis was to characterize the role of both Mediator kinases, on cell proliferation, gene expression and the response to cellular stress. After the generation of MEFs (Murine Embryonic Fibroblasts) knocked out for Cdk8, Cdk19 and Cdk8/19 by inducible Cre-Lox recombination and CRISPR-Cas9 approaches, I observed a reduction in the growth of populations of Cdk8/19 KO MEFs. Cell viability was not affected, but the loss of Cdk8/19 increased the expression of the cell cycle inhibitor p21. In addition, the loss of CDK8 and CDK19 hindered the exit of cells from quiescence induced by serum starvation. I also tested putative CDK8/19 inhibitors in vitro. To this end, I characterized their effect on CDK8/19 by analysing a model substrate, the phosphorylation of serine 727 of STAT1. Treatment of MEF with a specific inhibitor led to a reduced growth. The transcriptional effect of Cdk8/19 knockout or inhibition was then investigated. Given that the Mediator complexis essential for transcription the transcriptome was surprisingly little affected. The redundancy of CDK8 and CDK19 was clearly visible, while their combined inhibition had a distinct effect from their KO. Among the genes deregulated by both inhibition and loss of Cdk8/19, many are p53 targets, such as the cell cycle inhibitors Cdkn1a, Cdkn1b and Cdkn1c. UV-C response genes were also deregulated, and I focused on this novel finding. I found that loss, but not inhibition, of Cdk8/19 sensitizes MEFs to UV-C-induced apoptosis. In addition, in irradiated Cdk8/19 KO MEFs, p53 stabilisation occurs more rapidly, and depends on PML protein. While CDK8 was diffuse throughout the nucleus PML nuclear bodies were localized in areas with higher signal. Surprisingly, depletion of p53 and PML by siRNA further increased UV-C-induced apoptosis in Cdk8/19 KO MEFs. It therefore seems that the stabilization of p53 via PML limits apoptosis in mutant Cdk8/19 cells, perhaps by blocking the cell cycle. Finally, there was an increase in DNA damage in Cdk8/19 KO MEFs. Thus, my results reveal substantial redundancy between CDK8 and CDK19, as well as differences between inhibition and gene knockout. Moreover, my work suggests that these kinases, in which are dispensable in basal conditions, are essential for the cellular response to stress.