Visualisation de l’ADN G4 dans un Organisme Modèle (Levure S. cerevisiae) à l’aide d’Outils de Chimie Biologique

G4 DNA Visualization in Engineered S. cerevisiae with Chemical Biology Tools

• Auteur / Autrice : Mickaël Grandmougin
• Direction : Marie-Paule Teulade-fichou
• Type : Projet de thèse
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Inscription en doctorat le 01/10/2017
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes (Orsay, Essonne ; 2015-....)
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Chimie, modélisation et imagerie pour la biologie
• Partenaire(s) de recherche : établissement de préparation de la thèse : Université Paris-Sud (1970-2019)

Mots clés

Mots clés libres

Imagerie Chimique par spectrometrie de masse (nanoSIMS)

Sondes moléculaires

ADN G-quadruplex

Organisme modèle levure

Microscopie de fluorescence

Molecular reporters (probes)

Engineered yeast model

G-quadruplex DNA

Fluorescence imaging

NanoSIMS chemical imaging

Résumé

Les G- quadruplexes (G4) sont des structures d’ADN qui se forment dans des régions riches en motif guanine et qui jouent un rôle régulateur des principales fonctions de l’ADN. Ces structures sont dynamiques et donc difficile à détecter en milieu cellulaire. Afin surmonter les limites des méthodes de détection existantes, nous proposons de synthétiser des composés liant spécifiquement les structures G4 (ligands G4) et portant des fonctions ad hoc servant de marqueur pour leur localisation cellulaire. Pour ce faire deux approches seront développées : i) immunofluorescence guidée par des ligands G4, approche dite G4-GIS et ii) détection directe de ligand G4 par nanoSIMS (Imagerie basée sur la détection d’ions secondaires par spectrométrie de masse), approche dite G4-SIMS. Pour valider les deux méthodes de détection proposées, nous utiliserons un organisme modèle (levure) obtenu par transformation de la souche de S. cerevisiae dans laquelle des séquences humaines capables de générer des clusters de G-quadruplex seront introduites à un site déterminé.8 Dans l’approche G4-GIS, nous développerons des ligands fonctionnalisés avec des haptènes reconnus par des anticorps fluorescents disponibles commercialement, permettent ainsi la visualisation de séquences G4 par immunofluorescence guidée. La fixation de ces ligands dans les cibles G4 se fera soit par des interactions non covalentes, soit par génération d'une liaison covalente (alkylation in situ). Pour atteindre cet objectif, les petites molécules seront constituées de deux ou trois fragments différents: i) un noyau aromatique capable de lier le motif G4 (dérivés de phenanthroline, de pyridine ou polypyridooxazoles déjà développées au laboratoire ), ii) un haptène (par exemple, biotine , 5-bromodésoxyuridine) qui permettra de guider les anticorps sur le complexe généré entre la petite molécule et la structure d'ADN ciblée par une réponse immunitaire en présence d'anticorps ou d'un halogène qui permettra d'exploiter la spectroscopie à nanoSIMS pour la visualisation G4 et iii) un groupement alkylant (par exemple, la benzophénone, l'acide 4-azidobenzoïque et le chlorambucile). La capacité des ligands à interagir sélectivement avec l'ADN G-quadruplex sera évaluée en effectuant des analyses biophysiques classiquement utilisées dans le domaine, telles que la dénaturation thermique suivie par effet FRET (FRET melting), le déplacement compétitif d’une sonde fluorescente (G4-FID) et la spectroscopie de dichroisme circulaire (CD). En cas de réduction de la sélectivité vers l'ADN G4, une deuxième voie synthétique sera développée où la fonctionnalisation avec l’haptène sera effectuée par une réaction de click in situ. Les souches de levure modifiées avec des clusters G4 seront traitées avec les ligands de G4 afin d’évaluer les meilleurs candidats par des analyses biochimiques du génome de la levure. Ces derniers seront ensuite utilisés en cellules de levure pour mettre en œuvre les approches G4-GIS et G4-SIMS. Une fois les méthodes validées dans le modèle levure le transfert aux contextes cellulaires plus complexes (cellules de mammifère) sera envisagé.

To overcome the limits of existing methods for the detection and localization of G-quadruplexes in cells, we will design and synthesize functional G4-interactive compounds (G4 ligands) that should act as reporters for visualization of G4 localization in cells. This will be done via two approaches i) G4-ligand guided immunofluorescence staining and ii) G4-ligand direct detection by nanoSIMS (nanoscale secondary ion mass spectroscopy) a nanoscopic scale resolution chemical imaging mass spectrometer based on secondary ion mass spectrometry. The strong stabilization of G4 structures induced by ligand binding is expected to increase their lifetime, which will overcome the problems connected with their transient nature. Moreover, to validate the new proposed detection methods we will employ a model organism (yeast) obtained by transformation of S. cerevisiae strain in which human quadruplex forming sequences of interest will be introduced in the yeast genome.8 At first time, we will develop G4 selective ligands modified with carefully chosen haptens that are well-known to be recognized by commercially available antibodies thereby allowing visualization of G4 sequences by immunofluorescence staining. To reach this purpose, multifunctional small molecules able to selectively recognize G-quadruplex DNA will be synthesized. The recognition of these ligands can occur via a non-covalent interaction or via generation of a covalent bond once the ligand is localized on the G4 DNA. To pursue this goal, the small molecules will be functionalized with up to three different moieties: i) an aromatic core able to recognize and bind the G4 motif (e.g., phenantroline derivatives, pyridine derivatives, and polypyridooxazole derivatives already developed in the lab), ii) a hapten (e.g., biotin, 5-bromodeoxyuridine) that will allow detection of the complex or the alkylated adduct generated between the small molecule and the targeted DNA structure by immune response in the presence of antibodies or a halogen that will permit to exploit nanoSIMS for G4 visualization, and iii) an alkylating moiety (e.g., benzophenone, 4-azidobenzoic acid, and chlorambucil) able to generate a covalent bond with the G-quadruplex DNA and the ligand. The ability of the synthesized ligands to recognize and interact selectively with G-quadruplex DNA will be evaluated by performing biophysical assays largely applied in the research field, such as FRET melting, G4-FID, and CD spectroscopy. In case of reduced selectivity towards G4 DNA, a second synthetic pathway will be developed where functionalization via a click reaction in situ will be performed. The yeast strains modified with G4 clusters will be treated with the most selective G4 ligands and biochemical assays will be performed to evaluate the interaction between the synthesized ligands and the G4 structures. The same ligands will be employed to conduct both fluorescence and nanoSIMS microscopy to detect G-quadruplex in cells.