Etude de la régulation de l'architecture du réseau de microtubules

par Matthieu Gelin

Projet de thèse en Physique pour les Sciences du Vivant

Sous la direction de Laurent Blanchoin et de Manuel Théry.

Thèses en préparation à l'Université Grenoble Alpes (ComUE) , dans le cadre de École doctorale physique (Grenoble) , en partenariat avec Laboratoire de Physiologie Cellulaire Végétale (laboratoire) depuis le 19-10-2017 .


  • Résumé

    Etude de la régulation de l'architecture du réseau de microtubules Les microtubules sont des polymères semi-flexibles qui servent de rails pour le transport intracellulaire. Ces polymères sont instables et peuvent subrepticement dépolymériser complètement. Le réseau de microtubule est donc dynamique : il contient en permanence des microtubules qui polymérisent et d'autres qui dépolymérisent. Un comportement connu sous le nom d'instabilité dynamique. Leur nucléation à partir d'un centre organisateur, le centrosome, est à l'origine de la structure en aster du réseau. Le centre du réseau est généralement placé au centre de la cellule. Dans certaines conditions physiologiques bien définies (entrée en quiescence de la cellule, engagement de certains types d'interaction cellulaire, activation des lymphocytes, …) l'aster peut se reconfigurer de façon à briser la symétrie du réseau et déplacer le centrosome à la périphérie de la cellule. Les mécanismes de régulation de l'architecture du réseau permettant d'assurer la reconfiguration de l'aster et le centrage/décentrage du centrosome ne sont pas bien connus. Par ailleurs la nature et la distribution spatiale des contraintes dans le réseau de cellules au cours de ces transitions n'ont jamais été mesurées. La longueur de persistance des microtubules est de quelques millimètres. Elle est donc largement supérieure à la dizaine de micron que mesure les cellules dans lesquelles leur rigidité en flexion est donc considérable. Ils exercent donc des forces de pression conséquente sur les parois des cellules. Par ailleurs des moteurs moléculaires exercent des contraintes dans le réseau en se déplaçant sur les microtubules. Les dynéines tendent à mettre les microtubules sous tension en se déplaçant vers le centrosome. Certaines kinesines tendent à les mettre sous pression en se déplaçant dans le sens inverse. Par ailleurs, des protéines lient les microtubules entre eux et affectent la transmission des contraintes dans le réseau. Les amplitudes respectives de ces forces, leurs distributions spatiales et l'équilibre mécanique associé n'ont pas été mesurés expérimentalement. De plus les modèles actuels sont incapables d'expliquer correctement le mécanisme de centrage et le mécanisme de décentrage du réseau. En effet ces modèles sont basés sur des microtubules sous tension et dont la taille correspond au rayon des cellules ce qui correspond aux structures observées dans certains œufs ou embryons, mais l'architecture du réseau dans des cellules de mammifères en culture est bien plus complexe, comme en témoigne l'image ci-jointe. L'objectif du travail de thèse que nous proposons est de décrire et comprendre ce type d'architecture ainsi que les mécanismes assurant leur reconfigurations au cours de la brisure de symétrie. Une partie de notre équipé étudie cette question dans des cellules en culture contraintes sur des micropatrons de géométrie contrôlée (voir document attaché). Nous employons alors une approche de biologie cellulaire pour identifier et inactiver l'activité des moteurs et des protéines impliquées dans la régulation de l'architecture du réseau et le centrage du centrosome. Nous proposons ici de mettre en place une approche complémentaire dans un système moins physiologique mais mieux défini et par conséquent plus à même de permettre une description exacte de la structure et de la mécanique du système. Nous reconstituerons l'aster de microtubule in vitro à partir de protéines purifiées et nous induirons la production de contrainte en ajoutant des moteurs moléculaires ancrés -ou non - dans des films lipidiques microfabriqués. Notre laboratoire a déjà mis au point la reconstitution de la nucléation du microtubules à partir de centrosomes purifiés (Farina et al., 2016) ou de surface micropatternées (Portran et al., 2013). Nous avons déjà été amené à travailler avec des kinesines purifiées (Portran et al., 2013; Su et al., 2013) et nous avons une bonne expérience de l'utilisation d'autres moteurs moléculaires associés à l'actine (Reymann et al., 2012; Ennomani et al., 2016). Enfin nous avons déjà réussi à greffer des moteurs sur des micropatrons (Reymann et al., 2012) et venons récemment de développer une nouvelle méthode pour déposer des films lipidiques sur des micropatrons ce qui devrait nous permettre de mimer la réaction visqueuse suite au déplacement des moteurs nécessaire à l'induction de force de tension/pression sur les microtubules. Par conséquent, nous pensons avoir les moyens de réaliser le tour de force que représenterait la reconstitution in vitro du mécanisme d'interaction de l'aster de microtubule avec la membrane cellulaire. En parallèle nous souhaitons mettre au point un modèle physique de la distribution des contraintes dans le réseau. Les paramètres de ce modèle seront déduits des expériences précédentes et des simulations numériques nous permettront de tester leur effets sur l'architecture du réseau et la position du centrosome. Nous avons déjà initié ce type de travail dans une étude récente (Letort et al., 2016). Cependant l'architecture du réseau n'était pas suffisamment proche de la réalité pour rendre compte de la complexité de la distribution spatiale des contraintes engagées. Mais les outils sont disponibles au laboratoire. Nous pensons qu'en associant une approche expérimentale où la nature et la concentration de tous les composants sont connues et contrôlées à une approche théorique et numérique capable d'inclure ces mêmes composants dans des conditions spatiales très similaires nous seront capables de mettre à jour les lois de régulation de la structure du réseau de microtubules et de positionnement du centrosome ce qui constituerait un progrès majeur dans la compréhension de la structure et la polarité cellulaire.

  • Titre traduit

    Regulation of microtubule network architecture


  • Résumé

    Microtubules are semi-flexible polymers that serve as tracks for intracellular transport. These polymers are unstable and can depolymerize completely. The microtubule network is therefore dynamic: it contains overtime, microtubules which polymerize and others which depolymerize. A behavior known as dynamic instability. Their nucleation from an organizing center, the centrosome, is at the origin of the aster structure of the network. The center of the network is usually placed in the center of the cell. Under well-defined physiological conditions (cell quiescence, involvement of certain types of cellular interaction, lymphocyte activation, etc.), the aster can reconfigure itself to break the symmetry of the network and move the centrosome to the periphery of the cell. The mechanisms for regulating the network architecture to ensure the reconfiguration of the aster and the centering /decentring of the centrosome are not well known. Moreover, the nature and the spatial distribution of the stresses in the cell network during these transitions have never been measured. The persistence length of the microtubules is a few millimeters. It is therefore much greater than the tens of microns of the cells. Therefore, their flexural rigidity is considerable at a cellular scale. They can therefore exert forces of consequent pressure on the cell wall. Moreover, molecular motors exert stresses in the network by moving on the microtubules. The dyneins tend to put the microtubules under tension by moving towards the centrosome. Some kinesins tend to compact microtubules by moving them in the opposite direction. Moreover, proteins can interact with the microtubules and affect the transmission of stresses in the network. The respective amplitudes of these forces, their spatial distributions and the associated mechanical equilibrium have not been measured experimentally. In addition, current models are unable to correctly explain the centering and decentring mechanism. Indeed, these models are based only on microtubules under tension. However, the architecture of the cellular microtubule network is not consistent with this model. The objective of the thesis work is to describe and understand the overall microtubule network architecture as well as the mechanisms ensuring the reconfiguration of the aster following the centering /decentring of the centrosome. A part of our team is studying this issue in culture cells constrained on micropatterns of controlled geometry (see attached document). We then use a cell biology approach to identify and inactivate the activity of the motors and proteins involved in the regulation of the network architecture and centering of the centrosome. We propose here to implement a complementary approach in a system less physiological but better defined and therefore more suitable to allow an exact description of the network organization and the mechanism controlling the system dynamics. We will reconstitute the microtubule aster in vitro from purified proteins and induce stress production by adding molecular motors anchored or not in microfabricated lipid films. Our laboratory has already developed the reconstitution of microtubule nucleation from purified centrosomes (Farina et al., 2016) or micropatterned surfaces (Portran et al., 2013). We have an expertise in working with purified kinesins (Portran et al., 2013; Su et al., 2013) and have good experience in the use of molecular motors (Reymann et al Ennomani et al., 2016). Finally, we have already succeeded in grafting motors on micropatterns (Reymann et al., 2012) and have just recently developed a new method for generating lipid film on micropatterns which should allow us to mimic the viscous reaction following the displacement of the motors necessary for the induction of tensile/pressure force on the microtubules. Consequently, we believe that we have in hand all the necessary tools to reconstitute in vitro the interaction of the microtubule aster with the cell membrane. In parallel, we wish to develop a physical model of the distribution of constraints in the network. The parameters of this model will be deduced from the previous experiments and numerical simulations will allow us to test their effects on the network architecture and the position of the centrosome. We have already initiated this type of work in a recent study (Letort et al., 2016). However, the architecture of the network was not complex enough to account for the complexity of the spatial distribution of the constraints involved. But the tools are available in the laboratory. We believe that by associating an experimental approach where the nature and concentration of all components are known with a theoretical and numerical approach capable of including the same components under very similar spatial conditions we will be able to reveal the laws regulating the structure of the microtubule network and the control of the centrosome positioning which would constitute a major advance in the understanding of cytoskeleton organization and its role during cell polarity.