Etude du complexe actif de la NADPH oxydase en cellules vivantes à l’aide des protéines fluorescentes et des spectro-microscopies quantitatives

Live-cell investigation of the NADPH oxidase active state using fluorescent proteins and quantitative spectro-microscopies

• Auteur / Autrice : Hana Valenta
• Direction : Marie Erard
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Chimie
• Date : Soutenance le 28/09/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Sciences chimiques : molécules, matériaux, instrumentation et biosystèmes
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Institut de chimie physique (Orsay, Essonne ; 2000-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Faculté des sciences d'Orsay
• Jury : Président / Présidente : Sandrine Lévêque-Fort
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Vincent Jaquet, Franck Riquet, Stéphanie Bonneau, Pham My-Chan Dang
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Vincent Jaquet, Franck Riquet

Mots clés

Mots clés contrôlés

Protéine fluorescente verte

Microscopie de fluorescence

Transfert d'énergie entre molécules fluorescentes

Espèces réactives de l'oxygène et de l'azote

NADPH oxydase

Mots clés libres

NADPH oxydase

Ros

Fret

Flim

Tirf

Gfp

NADPH oxidase

Ros

Fret

Flim

Tirf

Gfp

Résumé

En cellules vivantes, les interactions dynamiques entre les protéines jouent un rôle clé dans la régulation de nombreuses voies de signalisation et événements biochimiques. C’est également le cas de la NADPH oxydase (NOX) des phagocytes, qui est une enzyme majeure du système immunitaire inné. Elle génère des anions superoxyde (O₂•⁻), précurseurs d’espèces réactives de l’oxygène (ROS), qui sont essentielles dans la lutte contre les infections microbiennes. La NADPH oxydase est un complexe protéique composé de six sous-unités ; deux protéines membranaires (NOX2 et p22phox) formant le centre catalytique, trois protéines cytosoliques (p67phox, p47phox et p40phox) et une petite GTPase Rac. Le mécanisme d’activation de la NADPH oxydase est basé sur l’assemblage de toutes les sous-unités cytosoliques avec les sousunités membranaire, où les interactions protéineprotéine jouent un rôle important. Un défaut d’activité de la NADPH oxydase cause une maladie granulomateuse septique chronique (CGD) caractérisée par des infections sévères et récurrentes. En revanche, des niveaux élevés de ROS contribuent aux maladies cardiovasculaires et neurodégénératives. Ainsi, l’activité de la NADPH oxydase doit être strictement régulée. Une meilleure compréhension de la machinerie de la NADPH oxydase au niveau moléculaire aidera à identifier les aspects clés de l’activité enzymatique et donc les potentielles cibles thérapeutiques. Le but de ma thèse était d’étudier l’état actif de la NADPH oxydase en utilisant des stratégies de microscopie à fluorescence en cellules vivantes. Pour détecter les interactions protéine-protéine, nous avons exploité le phénomène de transfert résonant d’énergie de type Förster (FRET) mesuré par imagerie de durée de fluorescence (FLIM). Étant donné que le phénomène de FRET a lieu uniquement entre des fluorophores proches spatialement (< 10 nm), il est approprié pour révéler les interactions à l’échelle nanométrique entre les sous-unités de la NOX étiquetées par des protéines fluorescentes (PFs) et il fournit également des informations sur la topologie du complexe enzymatique. Les approches de FRET-FLIM ont été réalisées soit avec des sous-unités séparées, soit avec une protéine de fusion chimérique appelée "Trimère". Le Trimère est composé des domaines essentiels des protéines cytosoliques p47phox, p67phox et Rac1, permettant une activité constitutive de la NADPH oxydase dans les cellules, sans avoir besoin d’un stimulant. Dans une première étape, nous avons travaillé avec les sous-unités individuelles étiquetés par les PFs dans les cellules de type fibroblastes ou dans des modèles de phagocytes. Nous avons comparé le PMA et l’acide arachidonique en tant qu’activateurs de la NADPH oxydase en termes de cinétique d’activation et de production de ROS. Les conditions expérimentales les plus convenables ont été explorées par la microscopie TIRF, qui permet d’exciter sélectivement des fluorophores situés près de la membrane plasmique et ainsi rend possible de suivre la formation du complexe actif de la NADPH oxydase en temps réel. Dans la deuxième partie de ma thèse, nous avons utilisé majoritairement le Trimère. Les expériences FRET-FLIM ont révélé que le Trimère forme des clusters dans la membrane plasmique. L’activité continue de la NADPH oxydase incité par le Trimère a été également examinée en termes de conséquences sur la physiologie des cellules vivantes. Nous avons montré que la production continue de ROS à long terme conduit à l’acidification du pH intracellulaire et déclenche l’apoptose.

In living cells, dynamic interactions between proteins play a key role in regulating many signaling pathways and biochemical events. It is also the case of the phagocyte NADPH oxidase (NOX), a key enzyme of the innate immune system. It generates superoxide anions (O₂•⁻), precursors of reactive oxygen species (ROS), such as hydrogen peroxide or hydroxyl radical that are critical for host responses to microbial infections. The NADPH oxidase is a protein complex composed of six subunits; two membrane proteins (NOX2 and p22phox) forming the catalytic core, three cytosolic proteins (p67phox, p47phox and p40phox) and a small GTPase Rac. The sophisticated activation mechanism of the NADPH oxidase relies on the assembly of all cytosolic subunits with the membrane-bound components, whereby proteinprotein interactions play an important role. Lack of the NADPH oxidase activity leads to chronic granulomatous disease (CGD) characterized by severe and recurrent infections. On the other hand, enhanced levels of ROS contribute to cardiovascular and neurodegenerative diseases. Thus, the NADPH oxidase activity needs to be tightly regulated in order to maintain physiological levels of ROS. Understanding the NADPH oxidase machinery at the molecular level will help to identify the key aspects of its enzyme activity and thereby potential therapeutic targets. The aim of my PhD project was to investigate the active state of the NADPH oxidase in living cells using state of the art fluorescence microscopy strategies. To detect the protein-protein interactions Förster Resonance Energy Transfer (FRET) measured by fluorescence lifetime imaging microscopy (FLIM) was a method of choice. As the FRET phenomenon occurs only between fluorophores in close proximity (< 10 nm), it is well-suited to reveal interactions of the NADPH oxidase subunits labeled by fluorescent proteins at nanoscale level, but also it provides information about the topology of the enzyme complex. FRET-FLIM was performed either with separated NOX subunits or with a chimeric fusion protein called “Trimera”. The Trimera is composed of the essential domains of the cytosolic proteins p47phox, p67phox and Rac1, enabling constitutive, robust NADPH oxidase activity in cells without the need of a stimulant. First, we worked with the individual FP-labeled cytosolic subunits in COSNOX cells (stably expressing NOX2/p22phox subunits) or macrophages and compared PMA and arachidonic acid as activators of the NADPH oxidase in terms of the activation kinetics and the total ROS production. By introducing mutations into the p47phox and p67phox subunits we were able to modulate the oxidase activity. The final validated working conditions were explored by TIRF microscopy, an imaging method allowing selective excitation of the fluorophores situated in the vicinity of the plasma membrane, and thus enabling to monitor the realtime formation of the active NADPH oxidase complex. We also focused on NOX2, the catalytic center of the NADPH oxidase that we labeled by FPs and prepared for further FRET-FLIM experiments aiming the investigation of NOX2/cytosolic subunits interactions. Second, we employed the Trimera that acts as a single activating protein of the NADPH oxidase. FRET-FLIM experiments revealed that theFP-Trimera forms clusters in the plasma membrane. The continuous long-term NOX activity elicited by the Trimera was also examined in terms of consequences on the physiology of living cells. We showed that the sustained ROS production leads to acidification of the intracellular pH and triggers apoptosis.