Fasciculation des axones et dynamique du cône de croissance en environnement confiné

par Audric Jan

Projet de thèse en Physique

Sous la direction de Catherine Villard et de Christian Specht.

Thèses en préparation à Paris Sciences et Lettres , dans le cadre de École doctorale Physique en Île-de-France (Paris) , en partenariat avec PhysicoChimie (laboratoire) et de Institut Curie (établissement de préparation de la thèse) depuis le 01-10-2017 .


  • Résumé

    La navigation des axones est une étape cruciale du développement assurant la mise en place de la connectivité cérébrale. Elle s'opère via divers mécanismes de guidage du cône de croissance, une structure motile et riche en actine localisée à l'extrémité de l'axone. Les axones pouvant progressant vers leur destination en formant des faisceaux, la fasciculation axonale est un processus clé impliqué dans le développement des systèmes nerveux central (SNC) et périphérique (SNP) et au cours de la régénération nerveuse. Cependant, nous en savons très peu sur les mécanismes mis en oeuvre au cours de ce phénomène. Des études réalisées sur des modèles insectes et le poisson-zèbre ont permis de mettre en évidence l'existence d'axones pionniers, générés tôt au cours du développement embryonnaire et constituant un substrat sur lequel les axones plus tardifs peuvent adhérer et croître. Dans le but de reproduire ces processus dans un environnement contrôlé, nous avons produit une puce microfluidique composée d'une chambre somato-dendritique et de micro-canaux axonaux présentant différents niveaux de confinement en largeur pour caractériser le phénomène de fasciculation. A partir de cultures de neurones hippocampaux murins, nous montrons que les faisceaux sont constitués de deux populations d'axones, les pionniers et les suiveurs, qui se différencient par leur comportement et la morphologie du cône de croissance. Les axones pionniers adoptent un comportement exploratoire caractérisé par une croissance discontinue due à une alternance entre périodes d'avancées et de pauses alors que les suiveurs présentent une croissance plus rapide et des pauses moins fréquentes. De plus, l'analyse morphologique des cônes de croissance révèle que ces structures sont plus larges chez les pionniers alors que ceux des suiveurs ont une forme plus allongée, suggérant une organisation polarisée des filaments d'actine dans la direction de croissance. De façon intéressante, lorsque les cônes de croissance pionniers sont hautement confinés et ainsi contraints d'adopter la morphologie des suiveurs, ils acquièrent également le comportement de ces derniers. Ces résultats nous amènent à nous interroger sur la nature du lien existant entre la forme et la dynamique du cône de croissance. Pour répondre à cette question, nous avons entrepris d'étudier l'organisation et la dynamique du cytosquelette d'actine en microscopie super-résolutive à molécule unique (single particle tracking based on photoactivated localization microscopy, sptPALM). A cette fin, nous avons fusionné l'actine à une protéine fluorescente photo-convertible (Eos-Actin) pour décrire l'organisation et quantifier la dynamique des filaments d'actine localisés dans les cônes de croissance des deux populations d'axones dans les différentes conditions de confinement. Les résultats préliminaires obtenus semblent indiquer que l'orientation des filaments définit un angle plus étroit chez les suiveurs et les pionniers très confinés que chez les pionniers non confinés. De plus, des mesures de vitesse du flux rétrograde d'actine (ARF) révèlent un flux plus rapide dans les cônes de croissance des pionniers non confinés. Ces résultats pourraient expliquer les différences de vélocité observées entre les deux populations d'axones. Toutefois, la vitesse de l'ARF étant de l'ordre de la centaine de nanomètres par seconde, elle est de plus d'un ordre de grandeur supérieure à la vitesse de migration des cônes de croissance. La vitesse de l'ARF ne peut donc pas expliquer à elle seule les différences de vitesse de croissance axonale observées. De prochaines investigations visant à quantifier la quantité ou la densité de filaments d'actine, ainsi que leur couplage à des molécules d'adhésion cellulaire, devraient nous permettre d'élucider certains des mécanismes moléculaires impliqués dans la dynamique de l'actine et le comportement de l'axone et in fine, d'améliorer notre compréhension de l'établissement de la connectivité neuronale.

  • Titre traduit

    Axonal fasciculation and growth cone dynamics in confining environments


  • Résumé

    Precise navigation of axons is crucial to establish in vivo neuronal networks. It relies on proper guidance of the growth cone, an actin-rich dynamic and pulling force-generating structure located at the axonal tip. Axons often progress toward their destination by forming bundles. Axonal fasciculation is therefore a key process involved in both central and peripheral nervous system development, or regeneration. However, little is known about the mechanisms underlying axon bundle formation in the developing brain. Studies performed in insects and zebra-fish have revealed the existence of pioneer axons generated at early stages of development, providing a substrate on which later axons can adhere and grow. To recapitulate these processes in a controlled environment, we produced a microfluidic chip composed of a large somato-dendritic chamber and thin axonal microchannels of various widths to characterize the phenomenon of axon fasciculation. Using primary murine hippocampal neurons, we show that bundles are composed of two populations of axons, pioneers and followers, that have distinct behaviors and growth cone morphologies. Pioneer axons display an explorative behavior, characterized by a discontinuous growth due to alternance of advancing and pausing periods, while followers exhibit a higher growth rate with less frequent pauses. Besides, morphological analysis of growth cones (GC) reveals that these structures are wider in pioneer axons, while GCs of follower axons display more elongated shapes, suggesting a polarized arrangement of actin filaments along the direction of growth. Interestingly, highly confined pioneer GCs adopt both follower morphologie and growth dynamics, suggesting that their confinement produces a follower-like behavior. These results prompted us to wonder about the nature of the link between GC shape and dynamics. We addressed this question by investigating the organization and dynamics of the actin cytoskeleton using single molecule super-resolution microscopy (single particle tracking based on photoactivated localization microscopy, sptPALM). To this aim, we fused actin with a photo-convertible fluorescent protein to describe the organization and to quantify the dynamics of actin filaments located in the growth cones of the two axon populations under different conditions of confinement. Preliminary results suggest that filament orientation defines a narrower angle in followers and in highly confined pioneers than in unconfined pioneers. Measurements of the actin retrograde flow rate (ARF) reveal a faster flow in the GC of unconfined pioneers. These results may explain the different growth velocities of pioneers and followers. However, since the ARF rate is about hundred nanometers per second, it is more than an order of magnitude greater than the growth cone migration speed. Therefore, ARF rate alone cannot explain the observed differences in axonal growth rate. Further investigations into quantifying the quantity or density of actin filaments, as well as their coupling to cell adhesion molecules, will be carried out to reveal the molecular mechanisms involved in actin dynamics and axon behavior, which may lead to a better understanding of the formation of neuronal connectivity.