Interaction de Pseudomonas aeruginosa avec les cellules sanguines humaines : caractérisation de nouveaux facteurs de virulence

par Stéphane Pont

Projet de thèse en Virologie - Microbiologie - Immunologie

Sous la direction de Ina Attree et de François Cretin.

Thèses en préparation à Grenoble Alpes , dans le cadre de Chimie et Sciences du Vivant , en partenariat avec BCI - Biologie du Cancer et de l'Infection (laboratoire) depuis le 26-09-2017 .


  • Résumé

    Pseudomonas aeruginosa (PA) est une bactérie à Gram négatif opportuniste, représentant une des principales causes d'infections nosocomiales, majoritairement responsable d'infections respiratoires et urinaires, ainsi que de la colonisation des plaies chez les grands brûlés. PA est également responsable d'infections chroniques chez les patients atteint de mucoviscidose. Le facteur de virulence majeur des souches classiques de PA est le système de sécrétion de type 3 (SST3), permettant à la bactérie de tuer les cellules immunitaires, conduisant à la persistance de PA dans l'organisme. Cependant, certains isolats cliniques n'expriment pas le SST3 et utilise une nouvelle toxine, l'Exolysine A (ExlA), responsable de la lyse de différents types cellulaires et de la mort des souris. Cependant, l'impact des souches exlA+ sur la réponse immunitaire de l'hôte commence juste à être étudié grâce à un modèle de sang total humain. Dans ce modèle d'infection, les souches exlA+ et SST3+diffèrent, notamment par leur habilité à induire la production de cytokines pro-inflammatoires. Le but de cette thèse est d'identifier et de caractériser de nouveaux facteurs bactériens affectant la virulence des souches exlA+. Cette étude sera conduite grâce à la technique de Tn-Seq, consistant à comparer l'abondance de mutants dans différentes conditions de sélection, par séquençage de nouvelle génération. Nous disposons d'une librairie de 300 000 mutants obtenue suite à une mutagénèse aléatoire par transposition de la souche IHMA. Cette banque sera incubée en sang, dans les conditions établies lors de mon M2 (condition avec pression de sélection), et cultivée dans un milieu de culture classique (condition contrôle). Après l'incubation, les bactéries seront lysées et leur matériel génétique sera extrait. Les régions d'ADN adjacentes au transposon seront amplifiées par PCR, puis le produit de cette amplification sera séquencé par séquençage à haut-débit de type Illumina. Les séquences obtenues (« reads ») seront alignées sur le génome de la souche IHMA, qui a été séquencé et assemblé dans le laboratoire, et l'abondance de ces séquences sera comparée entre les deux conditions d'incubation. Une analyse bio-informatique nous permettra de déterminer les gènes inactivés dans les mutants résistants en sang total. Ensuite, nous recréerons les mutants « propres » par délétion du gène en question et réexaminerons leurs phénotypes. Nous caractériserons les produits de ces gènes en déterminant comment ils affectent la sensibilité de la souche au sang. Nous examinerons également le devenir des leucocytes en sang total suite à leur contacte avec différentes souches de PA. Nous caractériserons la réponse cytokinique induite par la bactérie par cytométrie en flux à l'aide d'une méthode multiplexe, et par RT-qPCR. La nature des cellules produisant ces cytokines sera également déterminée. De plus, nous étudierons le rôle de la phagocytose et du complément dans l'élimination de souches exlA+ et SST3+, grâce à l'utilisation d'inhibiteurs comme la cytochalasine D et la compstatine. Finalement nous identifierons quelles voies d'activation du complément sont impliquées dans l'élimination des bactéries (voie classique, des lectines ou alterne).

  • Titre traduit

    Interaction of Pseudomonas aeruginosa with human whole blood cells : characterization of new virulence factors


  • Résumé

    Pseudomonas aeruginosa (PA) is an opportunistic gram negative bacteria which is one of the leading causes of nosocomial infections, mostly responsible of respiratory and urinary infection and colonization of wounds in burn patients. PA is also responsible of chronic infections in patient with cystic fibrosis. The main virulence factor of classical PA strains is the type 3 secretion system (TTSS), allowing the bacteria to kill the host immune cells, leading to the persistence of PA in the organism. However, some clinical isolates do not possess TTSS and use a new toxin, named Exolysin (ExlA) which is responsible for lysis of different cell lines and for mice mortality. However, the impact of exlA+ strains on host immune responses only starts to be explored using a human whole blood model. In this infection settings, the exlA+ and T3SS+ strains differ greatly concerning their infectivity (mortality of immune cells), sensibility to phagocytosis and ability to induce pro-inflammatory cytokines. The aim of the thesis is to identify and characterize new bacterial factors shaping virulence of exlA+ strains. This study will be conducted by Tn-Seq methodology that consists of comparing the abundance of mutants under different selection conditions, by new-generation sequencing. By using the previously obtained transposon library of 300,000 mutants in the exlA+ IHMA strain we will identify the mutants which are more adapted to survive within the blood, identify genes that have been disrupted by a transposon and study their implication in bacterial virulence. After a given incubation time, the mutant bacteria will be recovered from challenge condition considered as ‘'output'' (incubation with whole blood) and from the LB medium (‘'input''). The DNA of these two populations will be extracted and then analyzed by transposon insertion site sequencing (Tn-Seq). In this method, the DNA adjacent to the inserted transposon will be amplified, sequenced and mapped to the IHMA genome, allowing us to determine which genes have been disrupted in the surviving mutants. By comparing the data obtained from the input and the output, we will be able to identify the genes which are specifically involved in the survival of the bacteria within human blood. The next step will be to create a ‘'clean'' mutant, using site-directed mutagenesis, lacking one of those genes of interest. Depending of the protein which is absent in this mutant, different questions will be raised and various experiments will be carried out. We will further examine the status of immune cells (viability) in the whole blood and the cytokine response by multiplex and RT-PCR analysis upon infection. The nature of immune cells producing these cytokines will be examine by flow cytometry analysis. Furthermore the role of phagocytosis and complement activation will be determined. To find out if phagocytosis is involved, the effect of inhibitors like cytochalasine D on the viability on exlA+ and T3SS+ strains will be studied. We will also analyze the role of complement by performing in vitro studies with human normal serum to identify the implication of the classic, alternative, or the lectin pathways.