Régulation transcriptionnelle et épigénétique de la différenciation B normale et tumorale : rôle des enzymes Tet et du facteur de transcription SPI1

Transcriptional and Epigenetic Regulation of Normal and Malignant B-cell Differentiation : Role of Tet Enzymes and Transcription Factor SPI1

• Auteur / Autrice : Marine Armand
• Direction : Olivier Bernard, Said Aoufouchi
• Type : Thèse de doctorat
• Discipline(s) : Sciences de la vie et de la santé
• Date : Soutenance le 29/10/2020
• Etablissement(s) : université Paris-Saclay
• Ecole(s) doctorale(s) : École doctorale Cancérologie, Biologie, Médecine, Santé
• Partenaire(s) de recherche : Laboratoire : Dynamique moléculaire de la transformation hématopoïétique (Villejuif, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Partenaire(s) de recherche : référent : Université Paris-Saclay. Faculté de médecine (Le Kremlin-Bicêtre, Val-de-Marne ; 2020-....)
• Jury : Président / Présidente : Patricia Kannouche
• Jury : Examinateurs / Examinatrices : Jean Feuillard, Jean-Christophe Bories, Céline Delaloy, Fanny Baran-Marszak
• Jury : Rapporteurs / Rapporteuses : Jean Feuillard, Jean-Christophe Bories

Mots clés

Mots clés contrôlés

Lymphocytes B

Lymphome B

Épigénomique

Facteurs de transcription

Transcription génétique

Épigénétique

Mots clés libres

Epigénétique

Régulation transcriptionelle

Spi1

Tet

Lymphocytes B

Epigenetics

Transcriptional regulation

Spi1

Tet

B cells

Résumé

L’ontogenèse des lymphocytes B (LB) comporte une première phase de différenciation, dans la moelle osseuse en l'absence de toute stimulation antigénique spécifique, aboutissant au LB immature. La seconde phase, d’activation et de maturation finale, est dépendante des antigènes et se déroule dans les organes lymphoïdes secondaires, au sein de structures transitoires appelées centres germinatifs (CG). Elle génère des plasmocytes et des cellules B mémoires spécifiques d’un antigène.Ce travail de thèse s’intéresse à différents acteurs impliqués dans la régulation épigénétique et transcriptionnelle de la différenciation lymphoïde B terminale : les enzymes TET2 et TET3 et le facteur de transcription (FT) SPI1/PU.1. Des mutations affectant les gènes codant pour ces protéines sont trouvées dans les hémopathies chez l’Homme et nous avons cherché à déterminer leurs conséquences fonctionnelles en utilisant des modélisations in vivo et in vitro.J’ai d’une part analysé l’impact de la perte de fonction de TET2 sur la différenciation et la maturation des cellules B. Les résultats montrent un blocage de la différenciation plasmocytaire associé à une hyperplasie des CG et une augmentation du pourcentage et du nombre absolu des LB du CG (BGC). L’analyse par PCR quantitative de l’expression des FT importants pour la différenciation des BGC et des plasmocytes a montré que les cellules déficientes pour TET2 présentent une répression du gène Prdm1 codant pour BLIMP1, un régulateur essentiel de la différenciation plasmocytaire. Je me suis ensuite intéressée à TET3, autre protéine de la famille TET exprimée dans la lignée B. Les modèles Tet3-déficients in vivo et in vitro n’ont pas montré d’altération marquée de la différenciation B terminale.J’ai par ailleurs étudié une mutation somatique de SPI1/PU.1, identifiée par notre équipe chez des patients atteints de maladie de Waldenström (MW). Dans plus de 95% des cas, la mutation activatrice L265P du gène MYD88 est également présente. Nous avons montré que la mutation de SPI1, bien que n'empêchant pas sa liaison à l’ADN, modifie son affinité de liaison sur les sites normalement reconnus par la forme sauvage. La mutation semble faire adopter à cette protéine ETS de classe III un comportement qui ressemble à celui d'une classe I/IIa. J’ai ensuite cherché à documenter les bases de la coopération oncogénique entre SPI1 et MYD88 de deux façons. La première, en étudiant la prolifération et la différenciation de lymphocytes B naïfs issus d’un modèle murin knock-in pour la mutation SPI1 développé dans l’équipe, transduits avec un rétrovirus apportant la mutation de MYD88. Les résultats montrent une augmentation de la prolifération dans la condition double mutante ainsi qu’une augmentation de la différenciation terminale. La seconde approche consiste à modifier la lignée humaine BCWM1 de MW par CRISPR/Cas9 afin d’y introduire la mutation de SPI1 en même temps que l’expression de la GFP. Ce modèle sera notamment utilisé pour réaliser des expériences de ChIP-seq afin d’identifier les cibles de la protéine mutante dans un contexte MW-like.En conclusion, le respect des programmes transcriptionnels est essentiel pour le bon déroulement de la différenciation B terminale et peut être impacté soit directement, par des mutations affectant des FT comme SPI1, soit indirectement lorsque le profil de méthylation de gènes codant pour des FT (PRDM1) est altéré suite à des mutations affectant des enzymes comme TET2.

B-cell development involves a first phase of differentiation in the bone marrow, in the absence of any specific antigenic stimulation, leading to immature B-cells. The second phase, staging activation and final maturation, is antigen-dependent and takes place in the secondary lymphoid organs, within transient structures called germinal centers (GC). It generates antigen-specific plasma cells and memory B cells.This thesis work focuses on different actors involved in the epigenetic and transcriptional regulation of B-cell differentiation: the enzymes TET2 and TET3 and the transcription factor (TF) SPI1/PU.1. Mutations in genes encoding these proteins are found in human neoplasms, we used in vivo and in vitro models to determine their functional consequences.I analyzed the impact of TET2 loss of function on the differentiation and maturation of B-cells. The results show an impaired plasma cell differentiation associated with GC hyperplasia and an increase in the percentage and absolute number of GC B-cells (BGC). Quantitative PCR analysis of the expression of key BGC and plasma cell TF showed that Tet2-deficient cells exhibit repression of the Prdm1 gene encoding BLIMP1, a master regulator of plasma cell differentiation. I then turned my attention to TET3, another TET family protein expressed in the B-cell lineage. In vivo and in vitro Tet3-deficient models show that the loss of TET3 does not significantly affect terminal B differentiation.In addition, I studied a somatic mutation of SPI1/PU.1, identified by our team in patients with Waldenström's disease (WM). In more than 95% of cases, the L265P activating mutation of MYD88 gene is also present. We have shown that SPI1 mutation, although not preventing its binding to DNA, alters its binding affinity at sites normally recognized by the wild-type form. The mutation appears to cause this class III ETS protein to behave in a manner similar to a class I/IIa ETS protein. I then sought to document the basis for oncogenic cooperation between SPI1 and MYD88 in two ways. First, by studying the proliferation and differentiation of naïve B-cells from a locally developped mouse model knock-in for the SPI1 mutation, transduced with a retrovirus carrying the MYD88 mutation. The results show an increase in proliferation in the double mutant condition as well as an increase of the terminal differentiation. Second, by modifying the human BCWM1 WM cell line by CRISPR/Cas9 in order to introduce the SPI1 mutation at the same time as the expression of the GFP. This model will be used in particular to perform ChIP-seq experiments to identify the targets of the mutant protein in a MW-like context.In conclusion, compliance to transcriptional programs is essential for the smooth progress of B-terminal differentiation and can be impacted either directly, by mutations affecting TF such as SPI1, or indirectly when the methylation profile of key TF-encoding genes (PRDM1) is altered following mutations in enzymes such as TET2.