VALIDATION PAR BIOPHYSIQUE ET BIOLOGIE STRUCTURALE DE CIBLES THÉRAPEUTIQUES INNOVANTES

par Amandine Gontier

Projet de thèse en Biochimie et biologie structurale

Sous la direction de Jean-Baptiste Charbonnier.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de Innovation thérapeutique : du fondamental à l'appliqué , en partenariat avec Institut de Biologie Intégrative de la Cellule (I2BC) (laboratoire) et de université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 12-12-2016 .


  • Résumé

    Le projet de thèse CIFRE SANOFI­Vitry/CEA­Saclay porte sur la validation de molécules dirigées contre des cibles thérapeutiques majeures à l'aide de méthodes de biophysique et de biologie structurale. Ces cibles sont soit des protéines étudiées au centre SANOFI de Vitry et soit des protéines de la réparation de l'ADN étudiées dans le laboratoire de Biologie Structurale et Radiobiologie (I2BC, CEA, IBITECS, Saclay). L'étudiant bénéficiera d'une bourse CIFRE de SANOFI. Il caractérisera les interactions protéine-ligand des cibles étudiées à partir d'un ensemble large et très complémentaire de méthodes biophysiques qui sont disponibles au sein de ces deux laboratoires. Son objectif sera d'évaluer la qualité de nouvelles molécules comme médicaments potentiels dirigés contre des cibles étudiées au sein de ces deux laboratoires. Le développement de nouveaux médicaments nécessite des analyses quantitatives des paramètres d'interaction des nouvelles molécules proposées avec leur cible. Ces analyses s'appuient notamment sur des mesures biophysiques pour caractériser les paramètres thermodynamiques et cinétiques de ces interactions. Le site de recherche de SANOFI ­Vitry et le Laboratoire de Biologie Structurale et Radiobiologie (LBSR) du CEA de Saclay possèdent des méthodes tout à fait complémentaires dans la caractérisation des interactions protéine-­ligand. SANOFI a une expertise reconnue en Résonance Plasmonique de Surface (SPR), en Thermophorèse (MST) et en mesure de stabilité thermique (TSA). Le LBSR a de son côté une expertise reconnue en Microcalorimétrie (ITC), en RMN et production des protéines en cellules d'insectes ainsi qu'un accès à des appareils d'Ultracentrifugation Analytique couplée à de la fluorescence (UCA­fluo). De plus, le LBSR effectue une veille technologique depuis de nombreuses années sur des méthodes innovantes en termes de mesures d'interactions protéine­-ligand qui l'a amené récemment à investir dans une technologie innovante, le SwitchSense. L'étudiant en thèse dans le cadre de cette collaboration SANOFI­ CEA bénéficiera d'un ensemble unique de méthodes très complémentaires en mesures biophysiques des interactions protéine­-ligand. Ces outils lui permettront d'étudier des interactions entre des protéines cibles sélectionnées par SANOFI et d'autres étudiées au LBSR. Il bénéficiera du support dans ces deux laboratoires pour acquérir une formation solide sur l'ensemble de ces approches. Les cibles sélectionnées par SANOFI font l'objet d'une protection intellectuelle et ne peuvent être communiquées dans le contexte. Les cibles sélectionnées par le LBSR sont des protéines de réparation de l'ADN. Plusieurs travaux ont montré que la voie de réparation des cassures double ­brin de l'ADN est une cible importante pour identifier des nouveaux traitements anti­ cancer contre les tumeurs dites radio­ et chimio­résistantes. Ces tumeurs échappent aux traitements classiques de radio­ et chimiothérapie qui génèrent des cassures double ­brin de l'ADN par une sur­activation d'une voie de réparation de l'ADN, appelée voie NHEJ. Le LBSR travaille depuis de nombreuses années sur la voie NHEJ humaine. Le laboratoire a contribué à déterminer le mécanisme moléculaire de l'étape finale de cette voie de réparation en collaboration avec un laboratoire de l'institut Imagine (JP de Villartay). Nous avons déterminé la structure cristallographie d'un complexe entre deux co­facteurs de la ligase du NHEJ, la Ligase 4 (Malivert, 2010, J Biol Chem ; Ropars, 2011, PNAS ; Nemoz en préparation). Le laboratoire a également mis au point des protocoles robustes d'expression en cellules d'insectes et de purification de la plupart des facteurs de cette voie NHEJ. Il a de plus reçu deux financements, un programme labélisé ARC et un financement Franco ­Indien CEFIPRA, pour la caractérisation de nouveaux inhibiteurs de cette voie NHEJ. Un premier crible a été réalisé au CEA de Saclay sur un essai in cellulo mis au point à l'Institut Imagine. Une dizaine de molécules a été identifiée. L'étudiant caractérisa par des mesures biophysiques les interactions entre les molécules identifiées et les protéines de la voie NHEJ. Ces études permettront de sélectionner les molécules susceptibles d'être brevetées. Le projet est défini pour contenir une partie importante des travaux pouvant faire l'objet de publications scientifiques. Sur l'ensemble des projets, un article méthodologique comparera les performances des différentes méthodes pour obtenir des données reproductibles et précises de paramètres cinétiques et thermodynamiques. En particulier, l'étudiant en thèse évaluera l'apport de l'UCA-­fluo et du SwitchSense suivie par le LBSR. Cette dernière approche utilise des nanoleviers d'ADN qui sont marqués par une sonde fluorescente et bascule sur une surface en fonction de la charge électrique de cette surface, méthodologie récente appelé Swithsense (https://www.youtube.com/watch?v=amGw7txpGzM). Cette approche a été testée au LBSR avec succès sur des interactions entre des protéines de la voie NHEJ et leurs ligands naturels, protéine, peptide ou ADN. L'étudiant évaluera la pertinence de cette approche pour des mesures d'interactions protéine-­ligand. Un second volet du travail de thèse fera l'objet d'une ou deux publications. Il s'agit des informations fonctionnelles issues de ces caractérisations biophysiques quant au rôle des protéines cibles étudiées dans la cellule. A travers ce projet, l'étudiant en thèse acquerra une expertise très complète sur la caractérisation biophysique des interactions des protéines. Au cours de cette thèse, co-dirigée par Alexey Rak (SANOFI, Vitry) et par Jean-­Baptiste Charbonnier (CEA, Saclay), l'étudiant sera associé aux étapes en amont et en aval de la conception d'un médicament.

  • Titre traduit

    VALIDATION OF LIGANDABILITY FOR MEDICALLY RELEVANT PROTEIN TARGETS WITH A LARGE SET­UP OF BIOPHYSICAL APPROACHES


  • Résumé

    The thesis project CIFRE SANOFIVitry / CEASaclay deals with the validation of molecules directed against therapeutic targets using biophysical and structural biology methods. These targets are either proteins studied at the SANOFI center of Vitry and either of the DNA repair proteins studied in the Laboratory of Structural Biology and Radiobiology (I2BC, CEA, IBITECS, Saclay). The student will receive a CIFRE scholarship from SANOFI. She will characterize the protein-ligand interactions of the targets studied from a broad and very complementary set of biophysical methods that are available within these two laboratories. Her goal will evaluate the quality of new molecules as potential drugs targeted against targets studied within these two laboratories. The development of new drugs requires quantitative analyzes of the interactions parameters of new drugs molecules proposed with their target. These analyzes are based in particular on biophysical measurements to characterize thermodynamic and kinetic parameters of these interactions. The research site of SANOFI Vitry and the Laboratory of Biology Structural and Radiobiology (LBSR) of the CEA of Saclay possess quite complementary methods in the characterization of Protein interactions. SANOFI has a recognized expertise in Surface Plasmonic Resonance (SPR), in Thermophoresis (MST) and thermal stability (TSA) measurements. The LBSR has a recognized expertise in Microcalorimetry (ITC), in NMR and production of proteins in insect cells, as well as access to analytical Ultracentrifugation devices coupled with Fluorescence (UCA-fluo). In addition, the LBSR has been monitoring technology for many years on Innovative measures in terms of protein-protein interactions which led it recently to invest in innovative SwitchSense. The thesis student within the framework of this collaboration SANOFI CEA will benefit from a unique set of very complementary to biophysical measurements of protein-protein interactions. These tools will enable it to study interactions between of the target proteins selected by SANOFI and others studied at LBSR. She will benefit from support in these two laboratories to training on all these approaches. The targets selected by SANOFI are subject to intellectual protection and can not be disclosed in the context. The targets selected by LBSR are DNA repair proteins. Several studies have shown that the repair route of double-strand breaks in DNA is an important target for identifying new anticancer treatments against tumors called radio and chemoresistant. These tumors escape conventional radiation and chemotherapy treatments that DNA double strand breaks by overactivation of a DNA repair pathway, called the NHEJ pathway. The LBSR has since many years on the human NHEJ pathway. The laboratory helped to determine the molecular mechanism of the final step Of this repair route in collaboration with a laboratory of the Imagine Institute (JP de Villartay). We have determined the structure Crystallography of a complex between two co-factors of NHEJ ligase, Ligase 4 (Malivert, 2010, J Biol Chem, Ropars, 2011, PNAS, Nemoz in preparation). The laboratory has also developed robust insect cell purification of most of the factors of this NHEJ pathway. In addition, he received two funding, a program labeled ARC and one financing Franco Indian CEFIPRA, for the characterization of new inhibitors of this NHEJ pathway. A first screen was carried out at the CEA of Saclay on an in cellulo test developed at the Imagine Institute. Ten molecules have been identified. The student characterized by interactions between the identified molecules and proteins of the NHEJ pathway. These studies Will make it possible to select molecules that can be patented. The project is defined to contain a significant part of the work that may be the subject of scientific publications. Overall of the projects, a methodological article will compare the performances of the different methods to obtain reproducible data and precise parameters of kinetic and thermodynamic parameters. In particular, the thesis student will evaluate the contribution of UCAfluo and SwitchSense followed by the LBSR. The latter approach uses DNA nanolevers which are labeled with a fluorescent probe and Tilts on a surface according to the electrical charge of this surface, recent methodology called Swithsense (Https://www.youtube.com/watch?v=amGw7txpGzM). This approach has been successfully tested at LBSR on interactions between proteins of the NHEJ pathway and their natural ligands, protein, peptide or DNA. The student will evaluate the relevance of this approach to measures of protein-protein interactions. A second part of the thesis work will be the subject of one or two publications. These include functional information derived from these biophysical characterizations as to the role of the target proteins studied in the cell. Through this project, the thesis student will acquire a very complete expertise on the biophysical characterization of the interactions of proteins. During this thesis, co-directed by Alexey Rak (SANOFI, Vitry) and Jean-Baptiste Charbonnier (CEA, Saclay), the student will be associated with the upstream and downstream stages of drug design.