CONTROLE REDOX DE LA SECRETION EUCARYOTE

par Alexander Weiss

Projet de thèse en Sciences de la vie et de la santé

Sous la direction de Michel Toledano.

Thèses en préparation à Paris Saclay , dans le cadre de École doctorale Structure et Dynamique des Systèmes Vivants (Gif-sur-Yvette, Essonne) , en partenariat avec Service de Biologie Intégrative et Génétique Moléculaire (laboratoire) et de Université Paris-Sud (établissement de préparation de la thèse) depuis le 23-01-2017 .


  • Résumé

    CONTEXTE SCIENTIFIQUE Chez les eucaryotes, les protéines sécrétées sont initialement transloquées de façon cotraductionnelle dans le réticulum endoplasmique (RE), ou elles sont maturées, par repliement du polypeptide, puis acheminées à leur destination finale, la membrane ou sécrétées. La stabilité du repliement du polypeptide est assurée par des ponts disulfures dont la formation est catalysée par un relai redox comprenant l'oxydase Ero1, et la Protéine Disulfure Isomerase, PDI. La voie de sécrétion est essentielle au fonctionnement cellulaire, concernant environ 40% du protéome. Tout disfonctionnement de cette voie entrainera l'accumulation de protéines mal repliées génératrices de stress du RE, un défaut du fonctionnement cellulaire, et la mort cellulaire par apoptose ou nécrose. Cependant, le stress du RE active une réponse cellulaire, dite « Unfolded Protein Response » ou UPR, visant à corriger les causes du stress RE. Le stress du RE intervient dans le mécanisme d'une multitude de maladies humaines, métaboliques (diabète), neurodégénératives et le cancer. C'est pourquoi le RE est aujourd'hui une cible thérapeutique majeure. RESULTATS RECENTS DU LABORATOIRE SUR LESQUELS LE PROJET EST ETABLI Outre le relai redox du RE, la présence d'un système de réduction est probablement indispensable dans le RE pour antagoniser et réguler le relai redox, et d'éviter défaut ou l'excès de de ponts disulfures favorisant l'accumulation de protéines mal repliées. Nos travaux récents ont identifié le glutathion (GSH) comme système de réduction du RE, et montrent que son import y est régulé selon une boucle de rétrocontrôle négatif, permettant un contrôle reciproque de l'import de GSH et de l'activité d'Ero1. Ce couplage fait intervenir une production de peroxyde d'hydrogène (H2O2) par Ero1, qui en oxydant le chaperon du RE, Bip bloque alors l'import de GSH. En l'absence de cette régulation, l'import de GSH perpétue l'activation d'Ero1, ce qui entraine la mort cellulaire. Nous avons aussi montré que le canal de translocation des protéines dans le RE, Sec61, est le transporteur du GSH dans le RE. PROJET Nos résultats ouvrent trois axes de recherche interdépendants, au choix de l'étudiant : 1. Etablir l'importance physiologique du système d'import du GSH au cours du stress du RE, en regard de la régulation de la réponse UPR par la voie kinase Ire1, et de la voie de surveillance du RE par la MAPK Slt2. Comprendre le rôle du GSH dans le RE. 2. Elucider le mécanisme du transport du GSH dans le RE par Sec61 : nos résultats suggèrent l'existence d'autres protéines assistant Sec61 dont le rôle serait de coupler translocation des protéines et import du GSH dans le RE. Le RE servant de réservoir du calcium cellulaire, nous savoir s'il existe un couplage entre transport du GSH et du calcium. 3. La dérégulation du système décrit ci-dessus conduit à une mort cellulaire faisant intervenir des ROS mitochondriaux. Nous voudrions caractériser cette nouvelle voie de stress probablement d ‘importance majeure en pathologie humaine OUTILS Modèle d'étude : la levure S. cerevisiae. Techniques : biologie cellulaire et moléculaire, génétique, biochimie des protéines, microscopie de fluorescence, sondes redox dérivées de la GFP permettant de suivre le trafic intracellulaire du GSH, mesure de l'H2O2 dans le RE. EXPECTATIONS Projets à fort potentiel de découverte. Le contrôle redox de la sécrétion est au cœur du fonctionnement cellulaire et de la physiopathologie humaine, et sa dérégulation entraine un stress cellulaire que l'on ne peut correctement caractériser que chez la levure.

  • Titre traduit

    Redox control of eucaryotic secretion


  • Résumé

    BACKGROUND In eukaryotes, secreted proteins are initially co-translationally translocated to the endoplasmic reticulum (ER), where they are processed into their mature form by glycosylation and folding. These proteins then reach their final destination, the plasma membrane or the extracellular medium. The stability of the folded state of these proteins generally requires disulfide bonds, the formation of which is catalyzed by a redox relay made of the thiol oxidase Ero1 and protein disulfide isomerase (PDI). Secretion and hence the secretory pathway is essential as it involves about 40 % of the proteome. defects of the secretory pathway, or the presence of mutations in secretory proteins will lead to the accumulation of unfolded proteins causing ER stress, cellular dysfunction and eventually cell death. However, ER stress trigger a cellular adaptive response, called the unfolded protein response (UPR), which restores the altered ER folding condition. ER stress is at the crux of many human metabolic (diabetes), and neurodegenerative diseases and cancer, and constitute therefore a major therapeutic target. DATA FROM THE LABORATORY ON WHICH THE PROJECT IS DESIGNED In addition to the ER redox relay, oxidative protein folding requires the presence of an ER thiol reductive source for the isomerization of disulfides and the reduction of protein that are terminally misfolded. The glutathione (GSH) has been suspected as providing the ER reductive power, but this hypothesis has never been fully demonstrated, due to the total lack of knowledge of how this compound is imported into the ER. We have recently elucidated the mechanism used to import GSH into the ER. We found that GSH is imported into the ER through the protein-conducting channel Sec61 and that this transport is tightly regulated during the UPR by an oxidized form of the major ER Hsp70, Bip. The model drawn from our data suggest that, when imported into the ER, GSH activates Ero1 by reduction of its negative regulatory disulfides. Activated Ero1 generates H2O2 as byproduct of its catalytic cycle, which oxidizes Bip, thereby leading to inhibition of further GSH import into the ER. Hence this model suggests the presence of a reciprocal control of the ER import of GSH and activation of Ero1, a control that is essential for the maintenance of the ER redox poise. A defect of this regulation leads to the perpetuation of Ero1 catalytic cycling, which causes ER stress and cell death. PROJECT Many different questions can be raised form the above data, with each constituting an axis of research suitable for a PhD project: 1. Confirm the physiological importance of the regulated import mechanism during different conditions of acute and chronic ER stress, in relation to the regulation of UPR by the kinase Ire1 et of the ER surveillance pathway regulated by the kinase Slt2. This axis also involves elucidating the role of GSH into the ER and its importance during normal protein secretion. 2. The Translocon pore Sec61 serves as conduit for the import of GSH into the ER. However Sec61 does not operate alone. In fact, we genetically identified two other ORFs involved in the Er transport of GSH together with Sec61. The project will aim elucidate the function of the proteins encoded by these ORFs in the ER import of GSH. 3. Unresolved ER stress, permanent activation of Ero1 and excess import of GSH into the ER leads to cell death involving mitochondrial ROS production. The project will aim at elucidating the mitochondrial dependent ER cell death pathway. TOOLS AND EXPERIMENTAL APPROACHES Model system: S. cerevisiae. Technics and approaches cell and molecular biology, genetics, biochemistry, fluorescence microscopy, use of genetically-encoded GSH probes to monitor cellular GSH traffic and fluxes an H2O2. EXPECTATIONS Project with a high potential of discovery. ER stress is at the crux of human diseases, and S. cerevisiae constitutes a unique system to decipher its mechanisms.