Echappement de Leptospira interrogans aux récepteurs NOD1 et NOD2 et stratégies basées sur les agonistes NODs pour restaurer et renforcer les fonctions des macrophages

par Ignacio Santecchia

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Catherine Werts.

Thèses en préparation à l'Université de Paris (2019-....) , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité .


  • Résumé

    Les bactéries Leptospira interrogans sont des spirochètes pathogènes responsables de la leptospirose. Les rongeurs chroniquement infectés excrètent les bactéries dans leur urine, contribuant ainsi à la propagation de la maladie. Il n'existe actuellement aucun vaccin qui puissent conferer une protection croisée pour les 400 sérovars identifiés de leptospires. Les cellules immunitaires innées telles que les macrophages répondent rapidement aux microbes par le biais de récepteurs (PRR). Les PRR reconnaissent les motifs moléculaires conservés associés aux microbes (MAMP) et déclenchent des réponses immunitaires innées. Par exemple, les récepteurs NOD1 et NOD2 détectent le peptidoglycane (PG) et activent les réponses antimicrobiennes, parmi lesquelles l'autophagie. De plus, l'engagement des PRR peut déclencher une réponse mémoire immunitaire innée ou immunité entraînée (IE). Il a été démontré que les leptospires échappent à certaines réponses immunitaires innées. Le rôle des macrophages au cours de la leptospirose n'a pas encore été clairement établi. Les résultats antérieurs de notre laboratoire ont établi que la lipoprotéine LipL21 se lie au PG des leptospires, altérant la détection par les protéines NOD. Ma contribution a consisté à confirmer le rôle spécifique de la LipL21 sur l'évasion des NOD, en utilisant un système hétérologue d'expression chez E. coli, une bactérie à Gram négatif qui possède également un PG de type méso-Dap (Ratet, Santecchia et al. PLoS Pathog. 2017). Nous avons ensuite étudié les conséquences de l'échappement aux NOD dans les macrophages. Premièrement, des infections in vitro ont suggéré que les leptospires étaient internalisés indépendamment de la polymérisation de l'actine et survivaient dans les macrophages murins et humains pendant 48h. De plus, les leptospires ne déclenchent ni ne bloquent l'autophagie chez les macrophages murins. En outre, l'infection a induit sélectivement l'accumulation de l'adaptateur d'autophagie p62. De plus, le déclenchement pharmacologique de l'autophagie dans les cellules infectées a montré un effet marqué diminuant la viabilité des leptospires. La co-infection de leptospires avec des agonistes des NOD a induit l'autophagie et une dégradation de p62. De plus, des données préliminaires suggèrent que les leptospires ne provoquent pas d'autophagie dans le modèle murin et que l'autophagie au cours de l'infection par les leptospires peut être restaurée avec des agonistes des NOD. Enfin, en utilisant CL429, un agoniste de NOD2 / TLR2, nous avons démontré que l'IE protège de l'infection par les leptospires. Ce phénotype est indépendant des cellules B et T et est caractérisé par une réponse pro-inflammatoire accrue des macrophages péritonéaux et des cellules NK spléniques vis-à-vis de différents sérovars pathogènes de L. interrogans. En outre, le CL429 influence les cellules de la moelle osseuse, renforçant la réponse antibactérienne des macrophages dérivés de la moelle osseuse (BMM). Les PM et les BMM ont montré une activité bactéricide accrue parallèlement à une production accrue d'oxyde nitrique qui n'a jamais été associée auparavant à l'IE. Enfin, un entraînement ex vivo avec CL429 a également rendu les monocytes humains plus sensibles aux leptospires pathogènes (Santecchia et al., PLoS Pathog. 2019, in press).  En conclusion, nous avons montré que les leptospires échappent à l'autophagie, qui peut être partiellement restaurée à l'aide d'agonistes des NOD. De plus, la stimulation de macrophages avec des agonistes des NOD améliore leur réponse à différents sérovars pathogènes. Ces deux stratégies basées sur l'utilisation des agonistes des NOD pourraient être exploitées pour la prophylaxie ou la vaccination contre L. interrogans.

  • Titre traduit

    Leptospira interrogans' escape from NOD1 and NOD2 receptors and NOD-based strategies to restore and boost macrophage functions


  • Résumé

    Leptospira interrogans are pathogenic spirochetes responsible for leptospirosis. Chronically infected rodents excrete bacteria in their urine contributing to the spread of the disease. Currently, there is no cross-protective vaccine for more than 400 leptospiral serovars. Innate immune cells such as macrophages quickly respond to microbes through pattern-recognition receptors (PRRs). PRRs recognize conserved microbial-associated molecular patterns (MAMPs) and trigger innate immune responses. For instance, NOD1 and NOD2 receptors sense peptidoglycan (PG) and activate anti-microbial responses, among them autophagy. Furthermore, PRR engagement can trigger the so-called innate immune memory or trained immunity (TI). It has been shown that leptospires escape some innate immune sensing and the role of macrophages during leptospirosis has not yet been clearly established . Previous results from our laboratory established that the LipL21 lipoprotein binds to the leptospiral PG, impairing NOD sensing. My contribution was to confirm the specific role of LipL21 on NOD escape using the heterologous host E. coli that also harbors Gram-negative meso-Dap type PG (Ratet, et al PLoS Pathog. 2017). Next we studied the consequences of NOD escape in macrophages. First, in vitro infections suggested that leptospires were internalized independently of actin polymerization and survive in murine and human macrophages for 48h. Also, leptospires did not trigger nor block autophagy in murine macrophages. In addition, infection selectively induced the accumulation of the autophagy adaptor p62. Moreover, the pharmacological triggering of autophagy on infected cells had a marked effect decreasing the viability of leptospires. Co-infection of leptospires with NOD agonists induced autophagy and p62 degradation. In addition, preliminary data suggest that leptospires do not induce autophagy in the mouse model and that it can be restored with NOD agonists. Finally, using CL429, a NOD2/TLR2 agonist, we demonstrated that TI protects from leptospiral infection (Santecchia et al., PLoS Pathog. 2019). This phenotype was independent of B- and T-cells and characterized by the enhanced pro-inflammatory response of peritoneal macrophages (PMs) and splenic NK-cells towards different pathogenic serovars of L. interrogans. In addition, CL429 influences bone marrow cells, enhancing the antibacterial response of bone marrow-derived macrophages (BMMs). Both PMs and BMMs showed enhanced bactericidal activity alongside more nitric oxide production that has not been previously associated with TI. Finally, ex vivo training with CL429 renders human monocytes more responsive to pathogenic leptospires. In conclusion, we showed that leptospires escape autophagy and that it can be partially restored using NOD agonists. Moreover, training of macrophages with NOD agonists enhance their response toward different pathogenic serovars. Both NOD-based strategies could be exploited for prophylaxis or vaccination.