Déterminismes moléculaires de l'invasion tissulaire par Streptococcus pyogenes

par Antonin Weckel

Thèse de doctorat en Microbiologie

Sous la direction de Agnès Fouet.

Thèses en préparation à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Bio Sorbonne Paris Cité .


  • Résumé

    Streptococcus pyogenes, également appelé Streptocoque du Goupe A (SGA), est un pathogène à l'origine d'une grande diversité d'infections, allant d'infections superficielles comme l'angine aux infections invasives, comme la fasciite nécrosante et les endométrites. Au 19ème siècle, une femme sur dix mourait après l'accouchement de fièvre puerpérale, notamment d'endométrite. En France, les infections gynéco-obstétricales correspondent encore de nos jours à 27 % des infections invasives à SGA chez les femmes. Les souches de SGA présentent une forte diversité génétique et de répertoire de facteurs de virulence. Le génotype emm28 est le troisième génotype le plus prévalent en France et il est associé aux endométrites. Nous avons analysé par deux axes complémentaires les facteurs et mécanismes impliqués dans les endométrites à SGA. Par des approches de biochimie et de biologie cellulaire, nous avons caractérisé l'interaction entre les cellules de l'hôte et R28, une protéine de surface spécifique du génotype emm28. Le domaine N-terminal de R28 (R28Nt) et ses deux sous-domaines favorisent la fixation des bactéries à des cellules endométriales, cervicales et déciduales. Ils fixent de manière directe les intégrines ¿3¿1, ¿6¿1 et ¿6¿4. Par ailleurs, R28Nt promeut aussi l'adhésion à des cellules épithéliales de la peau et des poumons. Ces résultats suggèrent que la fixation des intégrines par R28Nt concourt, non seulement, aux endométrites dues au génotype emm28, mais aussi, et de manière plus générale, à la prévalence de ce génotype. Afin de mieux caractériser les étapes précoces essentielles au développement des endométrites à SGA, nous avons développé un modèle original d'infection : nous infectons ex vivo la décidue humaine, qui correspond à la membrane utérine durant la grossesse. Nous avons analysé les effets de l'infection de la décidue par des techniques de microscopie et d'analyse d'image de pointes. SGA adhère au tissu et se multiplie au contact de celui-ci grâce à des éléments sécrétés par le tissu. Sur ce tissu, SGA forme des biofilms composés d'ultrastructures ressemblant, pour certains, à des fils reliant deux coques d'une même chaine et, pour d'autres, à des filaments reliant plusieurs chaînettes ; certains s'organisent en réseau. GAS envahit en profondeur le tissu, ce qui dépend de l'expression de la cystéine protéase SpeB. SGA induit la mort de la moitié des cellules en moins de 4 h à travers la sécrétion de différents facteurs, dont la Streptolysine O (SLO). Enfin, GAS est capable de restreindre la réponse immunitaire du tissu à l'échelle transcriptomique et protéique, le contrôle protéique dépendant de l'expression de SLO et de SpeB.

  • Titre traduit

    Molecular mechanisms of Streptococcus pyogenes tissue colonization and invasion


  • Résumé

    Streptococcus pyogenes, also known as Group A Streptococcus (GAS), is a Gram-positive pathogen responsible for a wide range of diseases. GAS induces superficial infections such as pharyngitis, with 700 million cases/year worldwide, life threatening invasive infections such as necrotizing fasciitis, with 160 000 deaths, and post-infectious sequelae such as rheumatic fever. Altogether, GAS is responsible for 517 000 deaths in the world annually. GAS strains are genetically diverse and their genotyping involves the sequencing of the emm gene 5' end; emm encodes the M protein, a major virulence factor. More than 250 emm-types have been identified and they harbor specific virulence factor repertoires. During the pathogenesis of GAS infections, GAS adheres to the tissue, multiplies, affects the tissue integrity and invades it, resists and controls the immune response. During my PhD, we focused on deciphering the molecular mechanisms involved in GAS early critical steps of human tissue infection, with gyneco-obstetrical sphere infections, including endometritis, as a model. The first to third most prevalent emm-types eliciting invasive infections in Europe, emm28, is associated with these infections. In a first part of my project, we sought receptors for the emm28 specific R28 surface protein and which domains are involved in promoting adhesion to cells. In the second part, we set up an innovative ex vivo model of human decidual infection and we characterized the contribution of virulence factors to the colonization and invasion of this tissue. By cell adhesion experiments, we show that the R28 N-terminal domain (R28Nt) is responsible for an increase of GAS adhesion to human primary decidual cells. We have subdivided R28Nt into two subdomains; each is involved in binding to decidual, cervical and epithelial endometrial cells. We identified several putative R28Nt receptors and focused on R28Nt interaction with integrins. R28Nt and both subdomains directly interact with the integrins alpha3beta1, alpha6beta1 and alpha6beta4. Since R28Nt also increases the binding to the surface of pulmonary and skin epithelium cells, tissues encountered in GAS induced infections, we suggest that the R28Nt-integrin interactions contribute not only to emm28 endometritis, but also to the overall prevalence of the emm28 strains. In the second part of my project, to better characterize the mechanisms involved in GAS infections, we developed an ex vivo model of tissue infection, using human decidua, a tissue encountered during endometritis. We infected the maternal side of feto-maternal membrane, i. e. decidua, from healthy caesarians with an emm28 endometritis clinical isolate and its derived mutants. Using state of the art imaging set-up, image processing and analysis, we followed and quantified in real time different early infection steps. The bacteria multiply until they colonize the entire tissue surface in up to eight hours and this multiplication is triggered by the tissue. The bacteria form a multilayer biofilm of up to 14 µm thick. GAS readily and actively invades the decidua in a time-dependent manner, which depends on the presence of the cysteine protease SpeB. GAS induces dramatic cell cytotoxicity, with up to 50% of cells killed in the first four hours of infection; Streptolysin O (Slo) is involved in this cytotoxicity, confirming the critical importance of this factor in the early steps of infection. Cytokine overexpression and secretion in the tissue after infection indicate that GAS induces a limited immune response and the inflammatory response does not critically depend on the presence of Slo or SpeB. In conclusion, this study demonstrates the importance of several virulence factors, R28, SpeB and Slo, in the GAS emm28 early steps of infection, such as colonization, biofilm formation, cytotoxicity and tissue invasion, indicating their involvement not only in endometritis, but in other emm28 infections.