Evaluation de l'intégrité physique et fonctionnelle de la barrière hémato-encéphalique dans un modèle murin de neurodégénérescence; impact pharmacocinétique sur un exemple de candidat médicament

par Camille Taccola

Thèse de doctorat en Pharmacocinetique

Sous la direction de Fanchon Bourasset et de Xavier Decleves.

Thèses en préparation à Sorbonne Paris Cité , dans le cadre de École doctorale Médicament, toxicologie, chimie, imageries .


  • Résumé

    La barrière hémato-encéphalique (BHE), constituée par les cellules endothéliales des capillaires cérébraux (CECCs), est la principale interface d'échange entre le sang et le parenchyme cérébral. La présence de jonctions serrées (JS) entre les CECCs et de pompes d'efflux (protéines ABC (ATP-binding cassette)) garantissent la faible perméabilité de la BHE et la protection du cerveau vis-à-vis de substances potentiellement neurotoxiques. Cependant, cet effet barrière limite également la pénétration dans le système nerveux central (SNC) de molécules à visée cérébrale et peut ainsi être un frein à leur développement clinique. Les CECCs expriment aussi des récepteurs et transporteurs d'influx qui permettent l'entrée de molécules dans le SNC tels des nutriments. La question que nous nous posons est de savoir si des modifications de la BHE existent dans un contexte de neurodégénérescence et si ces modifications peuvent avoir des conséquences en termes de passage de la BHE de médicaments à visée cérébrale. Le premier objectif de notre travail était d'étudier l'intégrité physique et fonctionnelle de la BHE dans le modèle p25 (modèle murin présentant une neurodégénérescence rapide et sévère associée à une hyperphosphorylation de la protéine Tau). Grâce à l'association de différentes techniques incluant la perfusion cérébrale in situ (PCIS), l'imagerie confocale et la PCR quantitative, nous avons montré que la perméabilité de la BHE n'était pas augmentée et que le réseau vasculaire n'était pas atrophié chez les souris p25. En revanche, nous avons mis en évidence, chez les souris p25, une augmentation de l'expression du collagène IV dans la lame basale suggérant son épaississement, ainsi qu'une augmentation de l'expression génique d'une protéine de JS (ZO-1). Ces deux modifications pourraient expliquer la diminution du volume vasculaire cérébral observée chez ces souris. Sur le plan fonctionnel, les souris p25 présentent une diminution du transport cérébral du glucose, une augmentation de l'expression de Rage, l'acteur principal de l'influx cérébral du peptide bêta-amyloïde (Abêta), et une augmentation de l'expression des récepteurs et transporteurs actuellement connus pour être impliqués dans l'efflux cérébral du peptide Abêté et du cholestérol (Lrp1, P-gp, Bcrp, Abca1, Abca2, Abcg1 et Abcg4). Le second objectif de notre travail était d'étudier la pharmacocinétique et les caractéristiques de transport à travers la BHE d'un médicament candidat (PKRinh) à visée cérébrale, chez des souris saines et p25. Nos résultats chez la souris saine ont montré que sa partition cerveau-sang suite à son administration orale à la dose de 100 mg/kg était faible (Kpu,u,brain= 0,37), suggérant l'existence d'un efflux actif à la BHE. L'utilisation de la technique de PCIS a permis de confirmer cette hypothèse en montrant que PKRinh était efflué au niveau de la BHE par la P-glycoprotéine (P-gp) (Km= 3 µM, Vmax= 0,4 nmol/g/s). Cependant, PKRinh présente des caractéristiques neuropharmacocinétiques intéressantes, avec une clairance d'entrée cérébrale élevée (Clup= 14 µl/g/s) malgré un important efflux médié par la P-gp (rapport d'efflux= 4). Chez les souris p25, la capacité de transport de la P-gp est significativement augmentée vis-à-vis de PKRinh (Km= 13 µM, Vmax= 1,8 nmol/g/s), se traduisant par une diminution significative de sa Clup (7 µl/g/s) et de sa partition cerveau-sang (Kpu,u,brain= 0,1). En conclusion, ce travail de thèse confirme l'existence de modulations de la BHE dans un contexte de neurodégénérescence et d'hyperphosphorylation de Tau et démontre l'impact que ces modulations peuvent avoir sur la pénétration cérébrale d'un médicament visant à traiter les pathologies du SNC.

  • Titre traduit

    Evaluation of the physical and functional integrity of the blood-brain barrier in a mouse model of neurodegeneration; pharmacokinetic impact on a drug candidate


  • Résumé

    The blood-brain barrier (BBB), made of a monolayer of brain capillary endothelial cells (BCECs), is the main exchange interface between the blood and the brain parenchyma. The presence of tight junctions (TJ) between the BCECs and ATP-binding cassette (ABC) efflux transporters guarantee the low permeability of the BBB and the protection of the brain toward potentially neurotoxic substances. However, this barrier also limits the penetration of molecules intended to treat the central nervous system (CNS) and can thus be a challenge in their clinical development. The BCECs also express receptors and influx solute carriers (SLC) that allow the entry of molecules, such as nutrients, into the CNS. With this work, we would like to know if modifications of the BBB are present in a context of neurodegeneration and whether these modifications have consequences in terms of BBB transport of drugs aimed at treating the CNS. The first objective of our work was to study the physical and functional integrity of the BBB in the p25 model (a transgenic mouse model displaying a rapid and severe neurodegeneration associated with Tau hyperphosphorylation). Thanks to the combination of different techniques including in situ brain perfusion (ISBP), confocal imaging and quantitative PCR on isolated brain microvessels, we have shown that the permeability of the BBB is not increased and the vascular network is not atrophied in p25 mice. On the other hand, we found in p25 mice an increased expression of collagen IV in the basal lamina, suggesting a thickening of the microvessels walls, as well as an increase in the gene expression of a TJ protein (ZO-1). These two modifications could explain the decrease in cerebrovascular volume observed in these mice. Regarding the BBB functionality, the p25 mice show a decrease in cerebral glucose transport, an increase in the expression of Rage, the main amyloid beta peptide (Abeta) cerebral influx mechanism and an increase in the expression of the receptors and transporters currently known to be involved in the cerebral efflux of Abeta and cholesterol (Lrp1, P-gp, Bcrp, Abca1, Abca2, Abcg1 and Abcg4). The second objective of our work was to study the pharmacokinetics and BBB transport characteristics of a drug candidate (PKRinh), aimed at treating CNS diseases, in wild-type (WT) and p25 mice. Our results in WT mice showed that PKRinh brain/blood partition, following oral administration of 100 mg/kg, was low (Kpu,u,brain= 0.37), suggesting the existence of an active efflux at the BBB. The ISBP technique confirmed this hypothesis and showed that PKRinh was effluxed at BBB by the P-glycoprotein (P-gp) (Km= 3 µM, Vmax= 0.4 nmol/g/s). However, PKRinh displays interesting neuropharmacokinetic characteristics, with a high brain uptake clearance (Clup= 14 µl/g/s), despite being a good P-gp substrate (efflux ratio= 4). In p25 mice, the transport capacity of P-gp for PKRinh was increased (Km = 13 µM, Vmax= 1.8 nmol/g/s), resulting in a significant decrease in its Clup (7 µl/g/s) and brain/blood partition (Kpu,u,brain= 0.1). In conclusion, this work confirms the existence of BBB modulations in a context of neurodegeneration and Tau hyperphosphorylation, and demonstrates the impact of these modulations on the cerebral penetration of a drug aimed at treating CNS diseases.